Sığır Oositinde Mitokondriyal DNA'yı Azaltmak için Biseksiyon Kullanımı

Somatik hücre nükleer transferi (SCNT), bir hayvandan enüklee edilmiş bir oositin ve aynı türdeki bir hayvandan bir somatik hücrenin füzyonunu içerir. Çoğu durumda, oosit ve somatik hücre aynı türden kaynaklanır ve canlı doğum oranları %6’nın ^{altındadır1}. Bazı araştırmalar, iki farklı türden kaynaklanan somatik bir hücre ve oositin füzyonunu içeren türler arası SCNT’nin (iSCNT) kullanımını içerir. Bu çalışmalarda, canlı doğum oranları SCNT’den bile daha düşüktür – tipik olarak% 1’den ^azdır1. Bununla birlikte, iSCNT, nesli tükenmekte olan türleri kurtarma yöntemi olarak kullanılma kapasitesine sahiptir, çünkü bu hayvanlardan gelen somatik hücreler germ hücrelerinden daha erişilebilirdir¹. iSCNT’de kullanılan alıcı oositler genellikle inekler, domuzlar ve fareler gibi evcil veya yaygın laboratuvar türleridir. Şimdiye kadar yapılan bazı girişimler başarılı bir şekilde canlı genç üretmişlerdir, ancak üretilen yavrular intrajenerik hayvanlar olmuştur (alıcı oosit türleri ve donör hücre türleri aynı cinsin üyeleriydi)^2,3,4. Interjenerik modeller (farklı cinslerdeki hayvanlardan bir oosit ve somatik hücre kullanan) henüz canlı hayvanlar üretmemiştir ve yeniden yapılandırılmış embriyoların çoğu, in vitro gelişimin 8-16 hücre aşamasında tutuklanır ^5,6,7,8. Bu embriyonik gelişimsel arrestin olası bir açıklaması, embriyolarda mitokondriyal heteroplazminin ortaya çıkmasıdır – tek bir hücrede birden fazla mitokondri DNA (mtDNA) tipinin varlığı. Heteroplazmi, embriyoda veya canlı hayvanda gelişimsel verimsizlik veya başarısızlık gibi sorunlara yol açabilir¹. Patogenez, hayvanın yaşamının ilerleyen dönemlerinde de ortaya çıkabilir⁹. Bu sorun SCNT yavrularında da mevcut olmasına rağmen, iSCNT embriyolarındaki interspesifik bileşen sorunu daha da kötüleştirmektedir.

Embriyonik mtDNA iki farklı türden geldiğinde, çoğunluğu temsil eden alıcı oosit mitokondri, donör hücrenin çekirdeği^1,10 ile verimli veya etkili bir şekilde çalışmaz. iSCNT’de kullanılan iki tür arasındaki daha büyük taksonomik boşluklar muhtemelen bu sorunu yoğunlaştırır; Üretilen intrajenerik canlı yavruların (Bos taurus oositleri kullanan Bos gaurus ve Bos indicus yavruları) yanı sıra geleneksel SCNT yoluyla üretilen yavruların (örneğin, Ovis koç oositleri kullanan Yumurtalık Koç yavruları) kimera olduğu gösterilmiştir (bu hayvanlarda iki kişiden mtDNA^{mevcuttu 11,12,13}). Yine de, interjenerik SCNT embriyoları ^14,15’ten çok daha fazla geliştiler. Oosit mitokondrisi ile donör hücrenin çekirdeği arasındaki bilgi alışverişi, intrajenerik embriyoda interjenerik embriyodan daha başarılı olabilir¹⁶.

Olgun bir sığır oositindeki mtDNA miktarı, bir somatik hücrede bulunan miktardan yaklaşık 100 kat daha fazladır¹². Bu oranın azaltılması, somatik hücreli mitokondrinin yeniden yapılandırılmış embriyo içinde çoğalmasını teşvik edebilir ve daha büyük bir üretken mitokondri popülasyonunun bulunmasına izin verebilir¹⁶. Bu da gelişmekte olan embriyonun gereksinimlerini karşılamak için daha fazla enerji sağlayabilir¹⁵. Oosit veya embriyonun mtDNA kopya sayısını azaltmak için yapılan önceki girişimler arasında kimyasal uygulama, mikromanipülasyon ve yumurta veya embriyonun donör hücre türlerinden^{16,17,18,19,20} ek mitokondri ile takviye edilmesi yer almaktadır. Bununla birlikte, kimyasal uygulama (2′,3′-dideoksisitidin gibi) embriyonik gelişim için ideal değildir ve oosit mtDNA kopya sayılarını yaklaşık yarı yarıya¹⁸ oranında azaltmıştır. Mikromanipülasyon ile önceki oosit mtDNA indirgemesi, oositin mtDNA^17’sinin sadece% 64’ünü çıkarmıştır. Donör hücre mitokondrisinin takviyesi uygulanabilir bir seçenek olsa da, kullanımı henüz iSCNT çalışmaları^21’de canlı bir interjenerik hayvan üretmemiştir.

Oosit mtDNA kopya sayısını azaltmak için biseksiyon kullanımı henüz yayınlanmış çalışmalarda kullanılmamıştır. Ooblastları somatik bir hücre ile kaynaştırmak amacıyla oositlerin ikiye bölünmesi, tipik olarak polar cismi ve metafaz plakasını metafaz II (MII) oositinden çıkarma yöntemi olarak kullanılan el yapımı klonlamanın (HMC) öncülü. HMC, keçiler, sığırlar, domuzlar, koyunlar ve atlar^{22,23,24,25,26} dahil olmak üzere çeşitli türlerde başarıyla yavru üretmiştir^, ancak tipik olarak biseksiyondan önce bir santrifüjleme adımı içermez. Yumurtanın yüksek hızlı santrifüjlenmesinin entegre edilmesi, oositin bir kutbunda mitokondrinin (ve dolayısıyla mtDNA’nın) izolasyonuna izin verir, bu da daha sonra bu mitokondri-yoğun fraksiyonları çıkarmak için bir mikrobıçak kullanılarak ikiye bölünebilir. İki mitokondri tükenmiş ooplast, HMC’de olduğu gibi, oosit türlerinden önemli ölçüde daha az mtDNA içeren yeniden yapılandırılmış bir embriyo oluşturmak için somatik bir hücre ile kaynaştırılabilir.

Bu protokolle cevaplamaya çalıştığımız soru, daha az heteroplazmik mtDNA içeren uygulanabilir bir yeniden yapılandırılmış embriyo üretmek için sığır oositindeki mtDNA’nın nasıl azaltılacağıdır. Bu protokolde oositler santrifüj edilmiş ve ikiye bölünmüştür. Ooplast ve bozulmamış oosit mtDNA kopya sayıları, bu tekniğin sığır oositinin mtDNA kopya sayısını azaltmadaki etkinliğini belirlemek için hesaplandı.