Gebruik van bissectie om mitochondriaal DNA in de runderoöcyt te verminderen

Somatische celkernoverdracht (SCNT) omvat de fusie van een enucleated eicel van één dier en een somatische cel van een dier van dezelfde soort. In de meeste gevallen zijn de eicel en de somatische cel afkomstig van dezelfde soort en zijn de levende geboortecijfers lager dan 6%¹. Sommige onderzoeken omvatten het gebruik van interspecies SCNT (iSCNT), waaronder de fusie van een somatische cel en eicel die afkomstig zijn van twee verschillende soorten. In deze studies zijn de levende geboortecijfers zelfs lager dan in SCNT – meestal minder dan 1% ¹. iSCNT heeft echter de capaciteit om te worden gebruikt als een methode om bedreigde soorten te redden, omdat somatische cellen van deze dieren toegankelijker zijn dan hun geslachtscellen¹. Ontvangende eicellen die in iSCNT worden gebruikt, zijn vaak binnenlandse of veel voorkomende laboratoriumsoorten, zoals koeien, varkens en muizen. Sommige pogingen die tot nu toe zijn gedaan, hebben met succes levende jongen voortgebracht, hoewel de geproduceerde nakomelingen intragenerische dieren waren (de ontvangende eicelsoorten en donorcelsoorten waren leden van hetzelfde geslacht)^2,3,4. Intergenerische modellen (die gebruik maken van een eicel en somatische cel van dieren in verschillende geslachten) hebben nog geen levende dieren geproduceerd en de meerderheid van de gereconstrueerde embryo’s arresteert in het 8-16 celstadium van in vitro ontwikkeling 5,6,7,8. Een mogelijke verklaring voor deze embryonale ontwikkelingsstilstand is het optreden van mitochondriale heteroplasmie in de embryo’s – de aanwezigheid van meer dan één mitochondriaal DNA (mtDNA) type in een enkele cel. Heteroplasmie kan leiden tot problemen zoals ontwikkelingsinefficiëntie of falen in het embryo of bij het levende dier¹. Pathogenese kan ook later in het leven van het dier optreden⁹. Hoewel dit probleem ook aanwezig is bij SCNT-nakomelingen, verergert de interspecifieke component binnen iSCNT-embryo’s het probleem.

Wanneer het embryonale mtDNA afkomstig is van twee verschillende soorten, werken de ontvangende eicelmitochondriën, die de meerderheid vertegenwoordigen, niet efficiënt of effectief met de kern van de donorcel ^1,10. Grotere taxonomische verschillen tussen de twee soorten die in iSCNT worden gebruikt, verergeren dit probleem waarschijnlijk; intragenerische levende nakomelingen geproduceerd (Bos gaurus en Bos indicus nakomelingen met Bos taurus eicellen), evenals nakomelingen geproduceerd via traditionele SCNT (bijv. Ovis aries nakomelingen met Ovis aries oocyten) bleken chimaera’s te zijn (mtDNA van twee individuen was aanwezig in deze dieren 11,12,13). Toch ontwikkelden ze zich veel verder dan de intergenerische SCNT-embryo’s^14,15. De uitwisseling van informatie tussen de mitochondriën van de eicel en de kern van de donorcel zou succesvoller kunnen zijn in het intragenerische embryo dan in het intergenerische embryo¹⁶.

De hoeveelheid mtDNA in een volwassen runderoöcyt is ongeveer 100 keer groter dan de hoeveelheid die in één somatische cel wordt aangetroffen¹². Het verminderen van deze verhouding zou de somatische celmitochondriën kunnen aanmoedigen om zich te vermenigvuldigen in het gereconstrueerde embryo, waardoor een grotere populatie productieve mitochondriën aanwezig kan zijn¹⁶. Dit zou op zijn beurt meer energie kunnen leveren om aan de behoeften van het zich ontwikkelende embryo te voldoen¹⁵. Eerdere pogingen om het mtDNA-kopienummer van de eicel of het embryo te verminderen, omvatten chemische toepassing, micromanipulatie en het aanvullen van de eicel of het embryo met extra mitochondriën van de donorcelsoort 16,17,18,19,20. Chemische toepassing (zoals 2′,3′-dideoxycytidine) is echter niet ideaal voor embryonale ontwikkeling en heeft het aantal kopieën van eicellen met ongeveer de helft^{van 18} verminderd. Eerdere mtDNA-reductie van oöcyten door micromanipulatie hebben slechts gemiddeld 64% van het mtDNA¹⁷ van de eicel verwijderd. Hoewel de suppletie van donorcelmitochondriën een haalbare optie zou kunnen zijn, heeft het gebruik ervan nog geen levend intergenerisch dier opgeleverd binnen iSCNT-studies²¹.

Het gebruik van bisection om het mtDNA-kopienummer van de eicel te verminderen, is nog niet gebruikt in gepubliceerde studies. Het doorsnijden van eicellen met de bedoeling om de ooplasten te fuseren met een somatische cel is het uitgangspunt van handgemaakt klonen (HMC), dat meestal bisectie gebruikt als methode om het polaire lichaam en de metafaseplaat uit de metafase II (MII) eicel te verwijderen. HMC heeft met succes nakomelingen geproduceerd in verschillende soorten, waaronder geiten, runderen, varkens, schapen en paarden 22,23,24,25,26, maar omvat meestal geen centrifugatiestap voorafgaand aan bisectie. Het integreren van snelle centrifugatie van de eicel maakt de isolatie van mitochondriën (en dus mtDNA) aan één pool van de eicel mogelijk, die vervolgens kan worden doorsneden met behulp van een microblade om die mitochondria-dichte fracties te verwijderen. Twee mitochondriale uitgeputte ooplasten kunnen vervolgens worden gefuseerd met een somatische cel, zoals het geval is in HMC, om een gereconstrueerd embryo te vormen dat aanzienlijk minder mtDNA van de eicelsoort bevat.

De vraag die we met dit protocol proberen te beantwoorden, is hoe mtDNA in de runderoöcyt kan worden verminderd om een levensvatbaar gereconstrueerd embryo te produceren dat minder heteroplasmatisch mtDNA bevat. In dit protocol werden eicellen gecentrifugeerd en doorsneden. Ooplast en intacte oöcyt mtDNA-kopienummers werden berekend om de effectiviteit van deze techniek te bepalen bij het verminderen van het mtDNA-kopienummer van de runderoöcyt.