Uso de Bisection para reduzir DNA mitocondrial no Oócito Bovino

A transferência nuclear de células somáticas (SCNT) inclui a fusão de um oócito enucleado de um animal e uma célula somática de um animal da mesma espécie. Na maioria dos casos, o oócito e a célula somática são originários da mesma espécie, e as taxas de natalidade viva estão abaixo de 6%¹. Algumas pesquisas envolvem o uso de interespécies SCNT (iSCNT), que inclui a fusão de uma célula somática e oócito que se originam de duas espécies diferentes. Nesses estudos, as taxas de natalidade ao vivo são ainda menores do que no SCNT- tipicamente inferior a 1%¹. No entanto, o iSCNT tem a capacidade de ser usado como método de resgate de espécies ameaçadas de extinção, uma vez que as células somáticas desses animais são mais acessíveis do que suas células germinativas¹. Os oócitos receptores usados no iSCNT são frequentemente espécies domésticas ou comuns de laboratório, como vacas, suínos e camundongos. Algumas tentativas feitas até agora produziram com sucesso jovens vivos, embora os filhotes produzidos tenham sido animais intrageníricos (as espécies de oócitos receptores e espécies de células doadoras eram membros do mesmo gênero)^2,3,4. Os modelos intergênicos (que utilizam uma célula oótil e somática de animais em diferentes gêneros) ainda não produziram animais vivos, e a maioria dos embriões reconstruídos prende no estágio 8-16 de desenvolvimento in vitro ^5,6,7,8. Uma possível explicação para essa parada embrionária de desenvolvimento é a ocorrência de heteroplasmia mitocondrial nos embriões – a presença de mais de um tipo de DNA mitocôndria (mtDNA) em uma única célula. A heteroplasma pode levar a questões como ineficiência do desenvolvimento ou falha no embrião ou no animal vivo¹. A patogênese também pode ocorrer mais tarde na vida^{do animal 9}. Embora esta questão também esteja presente na prole do SCNT, o componente interespecífico dentro dos embriões iSCNT agrava a questão.

Quando o mtDNA embrionário vem de duas espécies diferentes, as mitocôndrias oócitos receptoras, que representam a maioria, não funcionam de forma eficiente ou eficaz com o núcleo ^1,10 da célula doadora. Maiores lacunas taxonômicas entre as duas espécies utilizadas no iSCNT provavelmente intensificam esse problema; descendentes vivos intragênicos produzidos (bos gaurus e bos indicus prole usando oócitos de Bos taurus), bem como descendentes produzidos através do TRADICIONAL SCNT (por exemplo, ovis aries prole usando oócitos Ovis aries) foram mostrados como quimeras (mtDNA de dois indivíduos estava presente nestes animais 11,12,13). No entanto, eles se desenvolveram muito mais do que os embriões SCNT intergênicos^14,15. A troca de informações entre as mitocôndrias oócitos e o núcleo da célula doadora poderia ser mais bem sucedida no embrião intragênico do que no embrião intergênico¹⁶.

A quantidade de dN em um oócito bovino maduro é aproximadamente 100 vezes maior do que a quantidade encontrada em uma célula somática¹². A redução dessa proporção poderia incentivar a proliferação das mitocôndrias celulares somáticas dentro do embrião reconstruído, permitindo que uma maior população de mitocôndrias produtivas esteja presente¹⁶. Isso poderia, por sua vez, fornecer mais energia para atender aos requisitos do embrião^{em desenvolvimento 15}. Tentativas anteriores feitas para reduzir o número de cópia de mtDNA do oócito ou embrião incluem aplicação química, micromanipulação e suplementação do oócito ou embrião com mitocôndrias adicionais da espécie celular doadora 16,17,18,19,20. No entanto, a aplicação química (como 2′,3′-dideoxycytidine) não é ideal para o desenvolvimento embrionário, e reduziu os números de cópias de oócito mtDNA em aproximadamente metade^{de 18}. A redução de oócitos anteriores por micromanipulação só removeu uma média de 64% do mtDNA¹⁷ do oócito. Embora a suplementação de mitocôndrias de células doadoras possa ser uma opção viável, seu uso ainda não produziu um animal intergenérico vivo dentro dos estudos do iSCNT²¹.

O uso de biseção para reduzir o número de cópia oócito mtDNA ainda não foi utilizado em estudos publicados. Bissectar oócitos com a intenção de fundir os ooplastos com uma célula somática é a premissa da clonagem artesanal (HMC), que normalmente utiliza biseção como método de remoção do corpo polar e placa de metafase do oócito metafase II (MII). O HMC produziu com sucesso descendentes em várias espécies, incluindo cabras, bovinos, suínos, ovinos e cavalos 22,23,24,25,26, mas normalmente não inclui um passo de centrifugação antes da biseção. A integração da centrífuga de alta velocidade do oócito permite o isolamento das mitocôndrias (e, portanto, mtDNA) em um polo do oócito, que pode então ser bissecto usando um microblade para remover essas frações mitocondria-densas. Dois ooplastos empobrecidos mitocôndrias podem então ser fundidos com uma célula somática, como é o caso do HMC, para formar um embrião reconstruído que contém consideravelmente menos mtDNA da espécie oócteto.

A pergunta que tentamos responder com este protocolo é como reduzir o dNM no oócito bovino, a fim de produzir um embrião reconstruído viável que contenha mtDNA menos heteroplasmica. Neste protocolo, os oócitos foram centrifudos e bisseccionados. Os números de cópias ooplastia e ooplasta ooplasta mtDNA foram calculados para determinar a eficácia desta técnica na redução do número de cópia mtDNA do oocito bovino.