Использование бисекции для уменьшения митохондриальной ДНК в бычьем ооците

Перенос ядра соматических клеток (SCNT) включает слияние энуклеированного ооцита одного животного и соматической клетки животного одного вида. В большинстве случаев ооциты и соматические клетки происходят от одного и того же вида, а показатели рождаемости ниже 6%¹. Некоторые исследования включают использование межвидового SCNT (iSCNT), который включает в себя слияние соматической клетки и ооцита, которые происходят от двух разных видов. В этих исследованиях уровень рождаемости даже ниже, чем в SCNT – обычно менее 1%¹. Тем не менее, iSCNT имеет возможность использоваться в качестве метода спасения исчезающих видов, поскольку соматические клетки этих животных более доступны, чем их половые клетки¹. Реципиентные ооциты, используемые в iSCNT, часто являются домашними или распространенными лабораторными видами, такими как коровы, свиньи и мыши. Некоторые попытки, предпринятые до сих пор, успешно произвели живого молодняка, хотя полученное потомство было внутриродовыми животными (виды ооцитов-реципиентов и донорских клеток были членами одного рода)^2,3,4. Межродовые модели (в которых используются ооциты и соматические клетки животных разных родов) еще не произвели живых животных, и большинство реконструированных эмбрионов останавливаются на 8-16 клеточной стадии развития in vitro 5,6,7,8. Одним из возможных объяснений этой остановки эмбрионального развития является возникновение митохондриальной гетероплазмы в эмбрионах – наличие более одного типа ДНК митохондрий (мтДНК) в одной клетке. Гетероплазма может привести к таким проблемам, как неэффективность развития или неудача у эмбриона или у живого животного¹. Патогенез также может произойти позже в жизни животного⁹. Хотя эта проблема также присутствует у потомства SCNT, межвидовой компонент в эмбрионах iSCNT усугубляет проблему.

Когда эмбриональная мтДНК поступает из двух разных видов, митохондрии реципиентов ооцитов, которые представляют большинство, не работают эффективно или результативно с ядром донорской клетки ^1,10. Большие таксономические разрывы между двумя видами, используемыми в iSCNT, вероятно, усиливают эту проблему; внутриродовое живое потомство (потомство Bos gaurus и Bos indicus с использованием ооцитов Bos taurus), а также потомство, полученное с помощью традиционного SCNT (например, потомство Ovis aries с использованием ооцитов Ovis) были химерами (мтДНК от двух особей присутствовала у этих животных 11,12,13). Тем не менее, они развивались намного дальше, чем межродовые эмбрионы SCNT^14,15. Обмен информацией между митохондриями ооцитов и ядром донорской клетки может быть более успешным во внутриродовом эмбрионе, чем в межродовом эмбрионе¹⁶.

Количество мтДНК в зрелом бычьем ооците примерно в 100 раз больше, чем количество, обнаруженное в одной соматической клетке¹². Снижение этого соотношения может стимулировать размножение митохондрий соматических клеток внутри реконструированного эмбриона, что позволяет увеличить популяцию продуктивных митохондрий¹⁶. Это, в свою очередь, может обеспечить больше энергии для удовлетворения потребностей развивающегося эмбриона¹⁵. Предыдущие попытки уменьшить число копий мтДНК ооцита или эмбриона включают химическое применение, микроманипуляцию и дополнение ооцита или эмбриона дополнительными митохондриями из донорских клеток 16,17,18,19,20. Однако химическое применение (например, 2′,3′-дидеоксицитидин) не идеально подходит для эмбрионального развития и снижает число копий мтДНК ооцитов примерно наполовину¹⁸. Предыдущее снижение мтДНК ооцитов путем микроманипуляции удаляло в среднем 64% мтДНК¹⁷ ооцита. Хотя добавление митохондрий донорских клеток может быть жизнеспособным вариантом, его использование еще не произвело живого межродового животного в исследованиях iSCNT²¹.

Применение бисекции для уменьшения числа копий мтДНК ооцитов еще не использовалось в опубликованных исследованиях. Бисектирование ооцитов с целью слияния оопластов с соматической клеткой является предпосылкой ручного клонирования (HMC), которое обычно использует бисекцию в качестве метода удаления полярного тела и метафазной пластины из метафазного II (MII) ооцита. HMC успешно произвел потомство у нескольких видов, включая коз, крупный рогатый скот, свиней, овец и лошадей ^{22,23,24,25,26}, но обычно не включает стадию центрифугирования до бисекции. Интеграция высокоскоростного центрифугирования ооцита позволяет выделить митохондрии (и, следовательно, мтДНК) на одном полюсе ооцита, который затем может быть разделен пополам с помощью микробелла для удаления этих митохондриально-плотных фракций. Два истощенных митохондриями оопласта затем могут быть слиты с соматической клеткой, как в случае с HMC, чтобы сформировать реконструированный эмбрион, который содержит значительно меньше мтДНК из видов ооцитов.

Вопрос, на который мы пытаемся ответить с помощью этого протокола, заключается в том, как уменьшить мтДНК в бычьем ооците, чтобы произвести жизнеспособный реконструированный эмбрион, который содержит меньше гетероплазматической мтДНК. В этом протоколе ооциты центрифугировали и делили пополам. Количество копий мтДНК ooplast и интактных ооцитов было рассчитано для определения эффективности этого метода в снижении числа копий мтДНК мтДНК крупного рогатого скота.