استخدام التقسيم الثنائي لتقليل الحمض النووي للميتوكوندريا في بويضة البقر

يشمل النقل النووي للخلايا الجسدية (SCNT) اندماج بويضة منزوعة النواة من واحد وخلية جسدية من من نفس النوع. في معظم الحالات ، تنشأ البويضة والخلية الجسدية من نفس النوع ، ومعدلات المواليد الأحياء أقل من 6٪ ¹. تتضمن بعض الأبحاث استخدام SCNT بين الأنواع (iSCNT) ، والذي يتضمن اندماج خلية جسدية وبويضة تنشأ من نوعين مختلفين. في هذه الدراسات ، تكون معدلات المواليد الأحياء أقل مما هي عليه في SCNT – عادة أقل من 1٪ ¹. ومع ذلك ، فإن iSCNT لديه القدرة على استخدامه كوسيلة لإنقاذ الأنواع المهددة بالانقراض ، لأن الخلايا الجسدية من هذه الحيوانات يمكن الوصول إليها أكثر من خلاياها الجرثومية¹. غالبا ما تكون البويضات المتلقية المستخدمة في iSCNT من الأنواع المختبرية المحلية أو الشائعة ، مثل الأبقار والخنازير والفئران. وقد نجحت بعض المحاولات التي بذلت حتى الآن في إنتاج صغار أحياء، على الرغم من أن النسل المنتج كان داخل الجنيسة (كانت أنواع البويضات المتلقية وأنواع الخلايا المانحة أعضاء من نفس الجنس)²،^3،4. النماذج البينية (التي تستخدم خلية بويضية وجسدية من الحيوانات في أجناس مختلفة) لم تنتج بعد حية، وغالبية الأجنة المعاد بناؤها تقبض في مرحلة 8-16 خلية من التطور المختبري ⁵،⁶،^7،8. أحد التفسيرات المحتملة لهذا الاعتقال التنموي الجنيني هو حدوث تباين الميتوكوندريا في الأجنة – وجود أكثر من نوع واحد من الحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNA) في خلية واحدة. يمكن أن يؤدي التغايرية إلى مشاكل مثل عدم الكفاءة التنموية أو الفشل في الجنين أو في الحيوان الحي¹. يمكن أن يحدث التسبب أيضا في وقت لاحق من حياة الحيوان⁹. على الرغم من أن هذه المشكلة موجودة أيضا في ذرية SCNT ، إلا أن المكون المشترك بين الأنواع داخل أجنة iSCNT يؤدي إلى تفاقم المشكلة.

عندما يأتي الحمض النووي الجنيني mtDNA من نوعين مختلفين ، فإن الميتوكوندريا البويضة المتلقية ، التي تمثل الأغلبية ، لا تعمل بكفاءة أو فعالية مع نواة الخلية المانحة ^1,10. ومن المرجح أن تؤدي الفجوات التصنيفية الأكبر بين النوعين المستخدمين في نظام iSCNT إلى تفاقم هذه المشكلة؛ وقد تبين أن النسل الحي داخل الجنيسة المنتجة (نسل Bos gaurus و Bos indicus باستخدام بويضات Bos taurus) ، وكذلك النسل المنتج عبر SCNT التقليدي (مثل ذرية Ovis aries باستخدام بويضات Ovis aries) هي أوهمات (mtDNA من شخصين كان موجودا في هذه الحيوانات¹¹،^12،13). ومع ذلك ، فقد طوروا أبعد بكثير من أجنة SCNT بين الجنيسة^14,15. يمكن أن يكون تبادل المعلومات بين الميتوكوندريا البويضة ونواة الخلية المانحة أكثر نجاحا في الجنين داخل الجنيسة منه في الجنين بين الجنيسة¹⁶.

كمية mtDNA في بويضة البقر الناضجة أكبر بحوالي 100 مرة من الكمية الموجودة في خلية جسدية واحدة¹². يمكن أن يؤدي تقليل هذه النسبة إلى تشجيع الميتوكوندريا ذات الخلايا الجسدية على التكاثر داخل الجنين المعاد بناؤه ، مما يسمح بوجود عدد أكبر من الميتوكوندريا المنتجة¹⁶. وهذا بدوره يمكن أن يوفر المزيد من الطاقة لتلبية متطلبات الجنين النامي¹⁵. تشمل المحاولات السابقة التي بذلت لتقليل عدد نسخ mtDNA للبويضة أو الجنين التطبيق الكيميائي ، والتلاعب المجهري ، واستكمال البويضة أو الجنين بالميتوكوندريا الإضافية من أنواع الخلايا المانحة 16،^17،18،^19،20. ومع ذلك ، فإن التطبيق الكيميائي (مثل 2′,3′-dideoxycytidine) ليس مثاليا للتطور الجنيني ، وقد قلل من أعداد نسخ mtDNA للبويضة بمقدار النصف تقريبا¹⁸. الحد من mtDNA البويضة السابقة عن طريق المعالجة الدقيقة قد أزال فقط ما معدله 64 ٪ من mtDNA¹⁷ في البويضة. على الرغم من أن مكملات الميتوكوندريا ذات الخلايا المانحة يمكن أن تكون خيارا قابلا للتطبيق ، إلا أن استخدامها لم ينتج بعد حيوانا حيا بين الأنواع في دراسات iSCNT²¹.

لم يتم بعد استخدام التقسيم الثنائي لتقليل عدد نسخ mtDNA للبويضة في الدراسات المنشورة. إن تقسيم البويضات بقصد دمج البلاستيدات مع خلية جسدية هو فرضية الاستنساخ اليدوي (HMC) ، والذي يستخدم عادة التقسيم الثنائي كوسيلة لإزالة الجسم القطبي والصفيحة الفوقية من بويضة الطور الثاني (MII). نجحت مؤسسة حمد الطبية في إنتاج ذرية في عدة أنواع، بما في ذلك الماعز والأبقار والخنازير والأغنام والخيول 22،23،^24،25،^26، ولكنها لا تتضمن عادة خطوة الطرد المركزي قبل التشريح. يسمح دمج الطرد المركزي عالي السرعة للبويضة بعزل الميتوكوندريا (وبالتالي mtDNA) في قطب واحد من البويضة ، والتي يمكن بعد ذلك تقسيمها باستخدام شفرة صغيرة لإزالة تلك الكسور الكثيفة من الميتوكوندريا. ويمكن بعد ذلك دمج اثنين من البلاستيدات المستنفدة للميتوكوندريا مع خلية جسدية، كما هو الحال في مؤسسة حمد الطبية، لتشكيل جنين أعيد بناؤه يحتوي على كمية أقل بكثير من الحمض النووي من أنواع البويضات.

السؤال الذي نحاول الإجابة عليه باستخدام هذا البروتوكول هو كيفية تقليل mtDNA في بويضة البقر من أجل إنتاج جنين قابل للحياة أعيد بناؤه يحتوي على mtDNA أقل غير متجانسة. في هذا البروتوكول ، تم طرد البويضات مركزيا وتقسيمها. تم حساب أرقام نسخ mtDNA للبويضة والبويضة السليمة لتحديد فعالية هذه التقنية في تقليل عدد نسخ mtDNA في بويضة البقر.