Utilisation de la bisection pour réduire l’ADN mitochondrial dans l’ovocyte bovin

Le transfert nucléaire de cellules somatiques (SCNT) comprend la fusion d’un ovocyte énucléé d’un animal et d’une cellule somatique d’un animal de la même espèce. Dans la plupart des cas, l’ovocyte et la cellule somatique proviennent de la même espèce et les taux de naissances vivantes sont inférieurs à 6 %¹. Certaines recherches impliquent l’utilisation de SCNT interespèces (iSCNT), qui comprend la fusion d’une cellule somatique et d’un ovocyte provenant de deux espèces différentes. Dans ces études, les taux de naissances vivantes sont encore plus bas que dans le SCNT – généralement inférieur à 1%¹. Cependant, l’iSCNT a la capacité d’être utilisé comme méthode de sauvetage d’espèces menacées, car les cellules somatiques de ces animaux sont plus accessibles que leurs cellules germinales¹. Les ovocytes receveurs utilisés dans l’iSCNT sont souvent des espèces de laboratoire domestiques ou communes, telles que les vaches, les porcs et les souris. Certaines tentatives faites jusqu’à présent ont réussi à produire des jeunes vivants, bien que la progéniture produite ait été des animaux intragénériques (les espèces d’ovocytes receveurs et les espèces de cellules donneuses étaient membres du même genre)^2,3,4. Les modèles intergénériques (qui utilisent un ovocyte et une cellule somatique d’animaux de différents genres) n’ont pas encore produit d’animaux vivants, et la majorité des embryons reconstruits s’arrêtent au stade 8-16 cellules du développement in vitro ^5,6,7,8. Une explication possible de cet arrêt du développement embryonnaire est l’apparition d’une hétéroplasmie mitochondriale dans les embryons – la présence de plus d’un type d’ADN mitochondrial (ADNmt) dans une seule cellule. L’hétéroplasmie peut entraîner des problèmes tels que l’inefficacité du développement ou l’échec de l’embryon ou de l’animal vivant¹. La pathogenèse peut également survenir plus tard dans la vie de l’animal⁹. Bien que ce problème soit également présent chez la progéniture SCNT, la composante interspécifique des embryons iSCNT exacerbe le problème.

Lorsque l’ADNmt embryonnaire provient de deux espèces différentes, les mitochondries ovocytaires receveuses, qui représentent la majorité, ne fonctionnent pas efficacement avec le noyau^1,10 de la cellule donneuse. Des écarts taxonomiques plus importants entre les deux espèces utilisées dans l’iSCNT intensifient probablement ce problème; La progéniture vivante intragénérique produite (progéniture Bos gaurus et Bos indicus utilisant les ovocytes Bos taurus), ainsi que la progéniture produite via la SCNT traditionnelle (par exemple, la progéniture Ovis aries utilisant des ovocytes Ovis aries) se sont révélées être des chimères (l’ADNmt de deux individus était présent chez ces animaux 11,12,13). Pourtant, ils se sont développés beaucoup plus loin que les embryons SCNT intergénériques^14,15. L’échange d’informations entre les mitochondries de l’ovocyte et le noyau de la cellule donneuse pourrait être plus efficace dans l’embryon intragénérique que dans l’embryon intergénérique¹⁶.

La quantité d’ADNmt dans un ovocyte bovin mature est environ 100 fois supérieure à la quantité trouvée dans une cellule somatique¹². La réduction de ce ratio pourrait encourager les mitochondries des cellules somatiques à proliférer dans l’embryon reconstruit, ce qui permettrait à une plus grande population de mitochondries productives d’être présente¹⁶. Cela pourrait à son tour fournir plus d’énergie pour répondre aux besoins de l’embryon^{en développement 15}. Les tentatives précédentes faites pour réduire le nombre de copies d’ADNmt de l’ovocyte ou de l’embryon comprennent l’application chimique, la micromanipulation et la supplémentation de l’ovocyte ou de l’embryon avec des mitochondries supplémentaires de ^l’espèce de cellule donneuse ^{16,17,18,19,20}. Cependant, l’application chimique (comme la 2′,3′-didéoxycytidine) n’est pas idéale pour le développement embryonnaire et a réduit le nombre de copies d’ADNmt ovocyte d’environ la moitié^{de 18}. La réduction antérieure de l’ADNmt ovocyte par micromanipulation n’a éliminé en moyenne que 64% de l’ADNmt^{17 de l’ovocyte}. Bien que la supplémentation en mitochondries de cellules donneuses puisse être une option viable, son utilisation n’a pas encore produit d’animal intergénérique vivant dans les études iSCNT²¹.

L’utilisation de la bisection pour réduire le nombre de copies de l’ADNmt ovocyte n’a pas encore été utilisée dans les études publiées. La coupe en deux des ovocytes dans l’intention de fusionner les ooplastes avec une cellule somatique est la prémisse du clonage fait à la main (HMC), qui utilise généralement la bisection comme méthode pour éliminer le corps polaire et la plaque de métaphase de l’ovocyte de métaphase II (MII). HMC a produit avec succès une progéniture chez plusieurs espèces, y compris les chèvres, les bovins, les porcs, les moutons et les chevaux 22,23,24,25,26, mais n’inclut généralement pas d’étape de centrifugation avant la bisection. L’intégration de la centrifugation à grande vitesse de l’ovocyte permet l’isolement des mitochondries (et donc de l’ADNmt) à un pôle de l’ovocyte, qui peut ensuite être coupé en deux à l’aide d’une microlame pour éliminer ces fractions denses en mitochondries. Deux ooplastes appauvris en mitochondries peuvent ensuite être fusionnés avec une cellule somatique, comme c’est le cas dans le HMC, pour former un embryon reconstruit qui contient beaucoup moins d’ADNmt de l’espèce ovocytaire.

La question à laquelle nous tentons de répondre avec ce protocole est de savoir comment réduire l’ADNmt dans l’ovocyte bovin afin de produire un embryon reconstruit viable qui contient moins d’ADNmt hétéroplasmique. Dans ce protocole, les ovocytes ont été centrifugés et coupés en deux. Le nombre de copies d’ooplast et d’ADNmt ovocytaire intact a été calculé pour déterminer l’efficacité de cette technique dans la réduction du nombre de copies d’ADNmt de l’ovocyte bovin.