Verwendung von Bisektion zur Reduzierung der mitochondrialen DNA in der Rinderzelle

Der somatische Zellkerntransfer (SCNT) umfasst die Fusion einer enukleierten Eizelle aus einem Tier und einer somatischen Zelle aus einem Tier derselben Art. In den meisten Fällen stammen die Eizelle und die somatische Zelle von derselben Art, und die Lebendgeburtenraten liegen unter 6%^1. Einige Forschungen beinhalten die Verwendung von Interspezies-SCNT (iSCNT), die die Fusion einer somatischen Zelle und einer Eizelle beinhaltet, die von zwei verschiedenen Arten stammen. In diesen Studien sind die Lebendgeburtenraten sogar niedriger als in SCNT – typischerweise weniger als 1%^1. iSCNT hat jedoch die Fähigkeit, als Methode zur Rettung gefährdeter Arten verwendet zu werden, da somatische Zellen dieser Tiere zugänglicher sind als ihre Keimzellen¹. Empfängeroozyten, die in iSCNT verwendet werden, sind oft heimische oder häufige Laborarten wie Kühe, Schweine und Mäuse. Einige bisher unternommene Versuche haben erfolgreich lebende Junge hervorgebracht, obwohl die produzierten Nachkommen intragenerische Tiere waren (die Empfänger-Eizellenarten und die Spenderzellarten waren Mitglieder derselben Gattung)^2,3,4. Intergenerische Modelle (die eine Eizelle und eine somatische Zelle von Tieren verschiedener Gattungen verwenden) haben noch keine lebenden Tiere hervorgebracht, und die Mehrheit der rekonstruierten Embryonen stoppt im 8-16-Zellstadium der In-vitro-Entwicklung 5,6,7,8. Eine mögliche Erklärung für diesen embryonalen Entwicklungsstillstand ist das Auftreten von mitochondrialer Heteroplasmie in den Embryonen – das Vorhandensein von mehr als einem Mitochondrien-DNA-Typ (mtDNA) in einer einzelnen Zelle. Heteroplasmie kann zu Problemen wie Entwicklungsineffizienz oder Versagen im Embryo oder im lebenden Tier^{führen 1}. Die Pathogenese kann auch später im Leben des Tieres auftreten⁹. Obwohl dieses Problem auch bei SCNT-Nachkommen auftritt, verschärft die interspezifische Komponente in iSCNT-Embryonen das Problem.

Wenn die embryonale mtDNA von zwei verschiedenen Spezies stammt, arbeiten die Mitochondrien der Empfängerzelle, die die Mehrheit darstellen, nicht effizient oder effektiv mit dem Kern der Spenderzelle ^1,10. Größere taxonomische Lücken zwischen den beiden in iSCNT verwendeten Arten verstärken dieses Problem wahrscheinlich; Intragenerische lebende Nachkommen, die produziert wurden (Bos gaurus und Bos indicus Nachkommen mit Bos taurus Eizellen), sowie Nachkommen, die über traditionelle SCNT produziert wurden (z. B. Ovis aries Nachkommen mit Ovis aries Eizellen) wurden als Chimären gezeigt (mtDNA von zwei Individuen war in diesen Tieren^{vorhanden 11,12,13}). Sie entwickelten sich jedoch viel weiter als die intergenerischen SCNT-Embryonen^14,15. Der Informationsaustausch zwischen den Mitochondrien der Eizellen und dem Zellkern der Spenderzelle könnte im intragenerischen Embryo erfolgreicher sein als im intergenerischen^{Embryo 16}.

Die Menge an mtDNA in einer reifen Rinderzelle ist etwa 100-mal größer als die Menge, die in einer somatischen Zelle^{gefunden wird 12}. Eine Verringerung dieses Verhältnisses könnte die Mitochondrien der somatischen Zellen dazu ermutigen, sich innerhalb des rekonstruierten Embryos zu vermehren, so dass eine größere Population produktiver Mitochondrien vorhanden sein^{kann 16}. Dies könnte wiederum mehr Energie liefern, um den Bedarf des sich entwickelnden Embryos^{zu decken 15}. Frühere Versuche, die mtDNA-Kopienzahl der Eizelle oder des Embryos zu reduzieren, umfassen die chemische Anwendung, Mikromanipulation und die Ergänzung der Eizelle oder des Embryos mit zusätzlichen Mitochondrien aus den Spenderzellspezies 16,17,18,19,20. Die chemische Anwendung (wie 2′,3′-Dideoxycytidin) ist jedoch nicht ideal für die Embryonalentwicklung und hat die MTDNA-Kopienzahlen der Eizellen um etwa^{die Hälfte von 18} reduziert. Frühere mtDNA-Reduktionen der Eizellen durch Mikromanipulation haben nur durchschnittlich 64% der mtDNA¹⁷ der Eizelle entfernt. Obwohl die Supplementierung von Spenderzellmitochondrien eine praktikable Option sein könnte, hat ihre Verwendung in den iSCNT-Studien noch kein lebendes intergenerisches Tier hervorgebracht²¹.

Die Verwendung von Bisektion zur Reduzierung der mtDNA-Kopienzahl der Eizellen wurde in veröffentlichten Studien noch nicht verwendet. Das Bisektieren von Eizellen mit der Absicht, die Ooplasten mit einer somatischen Zelle zu verschmelzen, ist die Prämisse des handgemachten Klonens (HMC), bei dem typischerweise Bisektion als Methode zur Entfernung des Polkörpers und der Metaphasenplatte aus der Metaphase II (MII) -Eizelle verwendet wird. HMC hat erfolgreich Nachkommen in mehreren Arten produziert, darunter Ziegen, Rinder, Schweine, Schafe und Pferde ^{22,23,24,25,26,} beinhaltet aber normalerweise keinen Zentrifugationsschritt vor der Bisektion. Die Integration der Hochgeschwindigkeitszentrifugation der Eizelle ermöglicht die Isolierung von Mitochondrien (und damit mtDNA) an einem Pol der Eizelle, die dann mit einer Mikroklinge halbiert werden kann, um diese mitochondriendichten Fraktionen zu entfernen. Zwei Mitochondrien-erschöpfte Ooplasten können dann, wie es bei HMC der Fall ist, mit einer somatischen Zelle zu einem rekonstruierten Embryo verschmolzen werden, der wesentlich weniger mtDNA von den Eizellenarten enthält.

Die Frage, die wir mit diesem Protokoll zu beantworten versuchen, ist, wie mtDNA in der Rinderzelle reduziert werden kann, um einen lebensfähigen rekonstruierten Embryo zu erzeugen, der weniger heteroplasmatische mtDNA enthält. In diesem Protokoll wurden Eizellen zentrifugiert und halbiert. Ooplast und intakte Eizelle mtDNA-Kopienzahlen wurden berechnet, um die Wirksamkeit dieser Technik bei der Reduzierung der mtDNA-Kopienzahl der Rinderzelle zu bestimmen.