Uso de la bisección para reducir el ADN mitocondrial en el ovocito bovino

La transferencia nuclear de células somáticas (SCNT) incluye la fusión de un ovocito enucleado de un animal y una célula somática de un animal de la misma especie. En la mayoría de los casos, el ovocito y la célula somática se originan en la misma especie, y las tasas de nacidos vivos están por debajo del 6%¹. Algunas investigaciones involucran el uso de SCNT entre especies (iSCNT), que incluye la fusión de una célula somática y un ovocito que se originan a partir de dos especies diferentes. En estos estudios, las tasas de nacidos vivos son incluso más bajas que en SCNT, típicamente menos del 1%¹. Sin embargo, iSCNT tiene la capacidad de ser utilizado como un método de rescate de especies en peligro de extinción, ya que las células somáticas de estos animales son más accesibles que sus células germinales¹. Los ovocitos receptores utilizados en iSCNT son a menudo especies domésticas o comunes de laboratorio, como vacas, cerdos y ratones. Algunos intentos realizados hasta ahora han producido con éxito crías vivas, aunque las crías producidas han sido animales intragenéricos (las especies de ovocitos receptores y las especies de células donantes eran miembros del mismo género)^2,3,4. Los modelos intergenéricos (que utilizan un ovocito y una célula somática de animales de diferentes géneros) aún no han producido animales vivos, y la mayoría de los embriones reconstruidos se detienen en la etapa de 8-16 células del desarrollo in vitro 5,6,7,8. Una posible explicación de este paro embrionario del desarrollo es la aparición de heteroplasmia mitocondrial en los embriones, la presencia de más de un tipo de ADN mitocondrial (ADNmt) en una sola célula. La heteroplasmia puede conducir a problemas como la ineficiencia del desarrollo o la falla en el embrión o en el animal vivo¹. La patogénesis también puede ocurrir más adelante en la vida del animal⁹. Aunque este problema también está presente en la descendencia de SCNT, el componente interespecífico dentro de los embriones de iSCNT exacerba el problema.

Cuando el ADNmt embrionario proviene de dos especies diferentes, las mitocondrias de los ovocitos receptores, que representan la mayoría, no funcionan de manera eficiente o efectiva con el núcleo^1,10 de la célula donante. Las brechas taxonómicas más grandes entre las dos especies utilizadas en iSCNT probablemente intensifican este problema; Se demostró que la descendencia viva intragenérica producida (descendencia de Bos gaurus y Bos indicus utilizando ovocitos de Bos taurus), así como la descendencia producida a través de SCNT tradicional (por ejemplo, descendencia de Ovis aries que usa ovocitos de Ovis aries) eran quimeras (el ADNmt de dos individuos estaba presente en estos animales ^11,12,13). Sin embargo, se desarrollaron mucho más allá de los embriones intergenéricos scnt^14,15. El intercambio de información entre las mitocondrias del ovocito y el núcleo de la célula donante podría tener más éxito en el embrión intragenérico que en el embrión intergenérico¹⁶.

La cantidad de ADNmt en un ovocito bovino maduro es aproximadamente 100 veces mayor que la cantidad encontrada en una célula somática¹². La reducción de esta proporción podría alentar a las mitocondrias de las células somáticas a proliferar dentro del embrión reconstruido, permitiendo que una mayor población de mitocondrias productivas esté presente¹⁶. Esto a su vez podría proporcionar más energía para satisfacer los requisitos del embrión en desarrollo¹⁵. Los intentos anteriores realizados para reducir el número de copias de ADNmt del ovocito o embrión incluyen la aplicación química, la micromanipulación y la suplementación del ovocito o embrión con mitocondrias adicionales de la especie de célula donante ^{16,17,18,19,20}. Sin embargo, la aplicación química (como la 2′,3′-didesoxicitidina) no es ideal para el desarrollo embrionario, y ha reducido el número de copias de ADNmt de ovocitos en aproximadamente la mitad¹⁸. La reducción previa del ADNmt de ovocitos por micromanipulación solo ha eliminado un promedio del 64% del ADNmt del ovocito¹⁷. Aunque la suplementación de mitocondrias de células donantes podría ser una opción viable, su uso aún no ha producido un animal intergenérico vivo dentro de los estudios iSCNT²¹.

El uso de la bisección para reducir el número de copias de ADNmt de ovocitos aún no se ha utilizado en los estudios publicados. La bisección de ovocitos con la intención de fusionar los ooplastos con una célula somática es la premisa de la clonación hecha a mano (HMC), que generalmente utiliza la bisección como método para eliminar el cuerpo polar y la placa metafásica del ovocito metafase II (MII). HMC ha producido con éxito descendencia en varias especies, incluyendo cabras, vacas, cerdos, ovejas y caballos 22,23,24,25,26, pero no suele incluir un paso de centrifugación antes de la bisección. La integración de la centrifugación de alta velocidad del ovocito permite el aislamiento de las mitocondrias (y por lo tanto del ADNmt) en un polo del ovocito, que luego se puede dividir en dos utilizando una microcuchilla para eliminar esas fracciones densas en mitocondrias. Dos ooplastos agotados por las mitocondrias se pueden fusionar con una célula somática, como es el caso en HMC, para formar un embrión reconstruido que contiene considerablemente menos ADNmt de la especie de ovocitos.

La pregunta que intentamos responder con este protocolo es cómo reducir el ADNmt en el ovocito bovino para producir un embrión reconstruido viable que contenga menos ADNmt heteroplásmico. En este protocolo, los ovocitos fueron centrifugados y bisectados. Se calcularon los números de copias de ADNmt de ooplastos y ovocitos intactos para determinar la efectividad de esta técnica en la reducción del número de copias de ADNmt del ovocito bovino.