שימוש בביזקציה להפחתת דנ"א מיטוכונדריאלי בביצית בקר
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול להפחתה משמעותית של מספרי העתקת הדנ”א המיטוכונדריאלי בביצת בקר (P < 0.0001). שיטה זו משתמשת בצנטריפוגה ובביסקציה כדי להפחית באופן משמעותי את המיטוכונדריה של הביציות ועשויה לאפשר סיכוי מוגבר להתפתחות בעוברי ההעברה הגרעינית של תאים סומטיים בין-מיניים משוחזרים.
Abstract
העברה גרעינית של תאים סומטיים בין-מיניים (iSCNT) עשויה לשמש להצלת מינים בסכנת הכחדה, אך שתי אוכלוסיות נפרדות של דנ”א מיטוכונדריאלי (mtDNA) קיימות בתוך העובר המשוחזר: אחת בתוך האופלסמה של המקבל ואחת בתוך התא הסומטי התורם. הטרופלזמה מיטוכונדריאלית זו עלולה להוביל לבעיות התפתחותיות בעובר ובעובר. פרוטוקולי שיבוט בעבודת יד כוללים ביסוס ביציות של ביציות, שניתן להשתמש בהן כדי להקטין את מספר העותקים של mtDNA, ובכך להפחית את מידת ההטרופלזמה המיטוכונדרית בעובר משוחזר. צנטריפוגה של ביציות בקר בוגרות ומבוגרות יצרה שבר נראה לעין של צפיפות מיטוכונדריה בקוטב אחד של הביצית. zonae pellucidae של ביציות הוסרו על ידי חשיפה לתמיסת פרונאז. ביזקציה בוצעה באמצעות מיקרובלייד כדי להסיר את שבר המיטוכונדריה הנראה לעין. qPCR שימש לכימות ה-mtDNA הקיים בדגימות דנ”א שחולצו מביציות שלמות ואופלסטים חתוכים, וסיפק השוואה בין מספרי העותקים של mtDNA לפני ואחרי הביזקציה. מספרי העותקים חושבו באמצעות ערכי סף מחזור, נוסחת קו רגרסיה של עקומה סטנדרטית ויחס שכלל את הגדלים המתאימים של מוצרי mtDNA PCR ומוצרי PCR גנומיים. לביצית בקר אחת היה מספר עותק mtDNA ממוצע (סטיית תקן ±) של 137,904 ± 94,768 (n = 38). לאופלסט אחד המדולדל ממיטוכונדריה היה מספר עותקים ממוצע של mtDNA של 8,442 ± 13,806 (n = 33). עותקי mtDNA ממוצעים שנכחו באופלסט עשיר במיטוכונדריה היו 79,390 ± 58,526 עותקי mtDNA (n = 28). ההבדלים בין ממוצעים מחושבים אלה מצביעים על כך שהצנטריפוגה והביסקציה שלאחר מכן יכולים להקטין באופן משמעותי את מספרי העותקים של mtDNA הקיימים באופלסט המדולדל ממיטוכונדריה בהשוואה לביצית המקורית (P < 0.0001, שנקבעה על ידי ANOVA חד-כיווני). הירידה ב-mtDNA אמורה להפחית את מידת ההטרופלזמה המיטוכונדריאלית בעובר משוחזר, וייתכן שהיא מעודדת התפתחות עוברית ועוברית סטנדרטית. תוספת עם תמצית מיטוכונדריאלית מתא התורם הסומטי עשויה גם היא להיות חיונית להשגת התפתחות עוברית מוצלחת.
Introduction
העברה גרעינית של תאים סומטיים (SCNT) כוללת היתוך של ביצית מפוחית אחת ותא סומטי מבעל חיים מאותו המין. ברוב המקרים, הביצית והתא הסומאטי מגיעים מאותו המין, ושיעורי הילודה החיה נמוכים מ-6%1. חלק מהמחקרים כוללים שימוש ב-SCNT בין-מיני (iSCNT), הכולל מיזוג של תא סומטי וביצית שמקורם בשני מינים שונים. במחקרים אלה, שיעורי הילודה החיה נמוכים אף יותר מאשר ב-SCNT – בדרך כלל פחות מ-1%1. עם זאת, ל-iSCNT יש את היכולת לשמש כשיטה להצלת מינים בסכנת הכחדה, שכן תאים סומטיים מבעלי חיים אלה נגישים יותר מתאי הנבט שלהם1. ביציות מקבלות המשמשות ב- iSCNT הן לעתים קרובות מיני מעבדה ביתיים או נפוצים, כגון פרות, חזירים ועכברים. כמה ניסיונות שנעשו עד כה הניבו בהצלחה חיים צעירים, אם כי הצאצאים שהופקו היו בעלי חיים תוך-גנריים (מיני הביציות המקבלים ומיני התאים התורמים היו חברים מאותו סוג)2,3,4. מודלים בין-גנריים (המשתמשים בביצה ותא סומטי מבעלי חיים בסוגים שונים) עדיין לא הניבו בעלי חיים חיים, ורוב העוברים המשוחזרים נעצרים בשלב של 8-16 תאים בהתפתחות במבחנה 5,6,7,8. הסבר אפשרי אחד למעצר התפתחותי עוברי זה הוא התרחשות של הטרופלזמה מיטוכונדריאלית בעוברים – נוכחות של יותר מסוג דנ”א מיטוכונדריה אחד (mtDNA) בתא בודד. הטרופלזמה יכולה להוביל לבעיות כגון חוסר יעילות התפתחותית או כשל בעובר או בחיה החיה1. פתוגנזה יכולה להתרחש גם מאוחר יותר בחייו של החיה9. למרות שבעיה זו קיימת גם אצל צאצאי SCNT, המרכיב הבין-ספציפי בעוברי iSCNT מחריף את הבעיה.
כאשר ה-mtDNA העוברי מגיע משני מינים שונים, המיטוכונדריה של הביציות המקבלות, המייצגות את הרוב, אינן פועלות ביעילות או ביעילות עם גרעין התא התורם 1,10. פערים טקסונומיים גדולים יותר בין שני המינים המשמשים ב-iSCNT ככל הנראה מעצימים בעיה זו; צאצאים חיים תוך-גנריים שהופקו (צאצאי Bos gaurus ו-Bos indicus באמצעות ביציות Bos taurus), כמו גם צאצאים שהופקו באמצעות SCNT מסורתי (למשל, צאצאי Ovis aries באמצעות ביציות של Ovis aries) הוכחו ככימרות (mtDNA משני פרטים היה נוכח בחיות אלה 11,12,13). עם זאת, הם התפתחו הרבה יותר רחוק מעוברי SCNT הבין-גנריים14,15. חילופי המידע בין המיטוכונדריה של הביצית לבין גרעין התא התורם יכולים להיות מוצלחים יותר בעובר התוך-גנרי מאשר בעובר הבין-גנרי16.
כמות ה-mtDNA בביצית שור בוגרת גדולה בערך פי 100 מהכמות שנמצאה בתא סומטי אחד12. הפחתת יחס זה עשויה לעודד את המיטוכונדריה של התאים הסומאטיים להתרבות בתוך העובר המשוחזר, מה שיאפשר לאוכלוסייה גדולה יותר של מיטוכונדריה יצרנית להיות נוכחת16. זה בתורו יכול לספק יותר אנרגיה כדי לענות על הדרישות של העובר המתפתח15. ניסיונות קודמים שנעשו להפחית את מספר העותקים של mtDNA של הביצית או העובר כוללים יישום כימי, מיקרומניפולציה, והשלמת הביצית או העובר עם מיטוכונדריה נוספת ממיני התאים התורמים 16,17,18,19,20. עם זאת, יישום כימי (כגון 2′,3′-dideoxycytidine) אינו אידיאלי להתפתחות עוברית, והפחית את מספר העותקים של mtDNA של הביציות בכמחצית18. הפחתה קודמת של mtDNA בביציות על ידי מיקרומניפולציה הסירה רק 64% בממוצע מה-mtDNA17 של הביצית. אף על פי שהתוספת של מיטוכונדריה של תאים תורמים יכולה להיות אפשרות מעשית, השימוש בה עדיין לא הניב חיה בין-גנרית חיה במחקרי iSCNT21.
השימוש בביזקציה להפחתת מספר העותקים של mtDNA של הביציות עדיין לא שימש במחקרים שפורסמו. חיתוך ביציות מתוך כוונה למזג את האופלסטים עם תא סומטי הוא הנחת היסוד של שיבוט בעבודת יד (HMC), אשר בדרך כלל משתמשת בביזקציה כשיטה להסרת גוף הקוטב וצלחת המטאפאזה מהביצית מטאפאזה II (MII). HMC ייצרה בהצלחה צאצאים בכמה מינים, כולל עזים, בקר, חזירים, כבשים וסוסים 22,23,24,25,26, אך בדרך כלל אינה כוללת שלב צנטריפוגה לפני הביזקציה. שילוב צנטריפוגה במהירות גבוהה של הביצית מאפשר בידוד של מיטוכונדריה (ולכן mtDNA) בקוטב אחד של הביצית, אשר לאחר מכן ניתן לחתוך באמצעות microblade כדי להסיר את אותם שברים צפופי מיטוכונדריה. לאחר מכן ניתן למזג שני אופלסטים מדולדלים ממיטוכונדריה עם תא סומטי, כפי שקורה ב-HMC, כדי ליצור עובר משוחזר המכיל הרבה פחות mtDNA ממיני הביציות.
השאלה שאנו מנסים לענות עליה באמצעות פרוטוקול זה היא כיצד להפחית את mtDNA בביצת הבקר על מנת לייצר עובר משוחזר בר קיימא המכיל פחות mtDNA הטרופלסמי. בפרוטוקול זה, הביציות היו צנטריפוגות וחתכו. מספרי העותקים של אופלסט וביצית שלמים mtDNA חושבו כדי לקבוע את היעילות של טכניקה זו בהפחתת מספר העותקים mtDNA של הביצית הבקר.
Protocol
Representative Results
Discussion
לשיטות ששימשו בעבר להפחתת מספרי העותקים של mtDNA בביציות יש חסרונות בהתאמה. הסרה מבוססת מיקרומניפולציה של מיטוכונדריה מביציות מקטינה את מספר העותקים של mtDNA ב-64% 27 בממוצע. שיטה ייחודית, ששימשה בעבר להאנשה, כוללת שימוש בפיפטות פסטר בקוטר קטן ופיצול של ביצית נטולת פלוצ’ידה בגבול שב?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לעמיתיהם באוניברסיטת יוטה סטייט, לחוקרי מדעי הרבייה בגן החיות של סן דייגו ולד”ר רבקה קרישר מ-Genus PLC.
Materials
| 1.5 mL centrifuge tubes | Fisher Scientific | 5408129 | |
| 60 mm dish | Sigma-Aldrich | D8054 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | C6762 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| M199 Media | Sigma-Aldrich | M4530 | |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| Mini Centrifuge | SCILOGEX | D1008 | |
| mtDNA Primer: Forward (12S) | GGGCTACATTCTCTACACCAAG | ||
| mtDNA Primer: Reverse (12S) | GTGCTTCATGGCCTAATTCAAC | ||
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000 | |
| Opthalmic Scalpel with Aluminum Handle | PFM Medical | 207300633 | Microblade for bisection |
| Protease/pronase | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| QIAamp DNA Micro Kit | Qiagen | 56304 | |
| QuantStudio™ 3 – 96-Well 0.2-mL | ThermoFisher | A28567 | |
| Search plate | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| SYBR Green qPCR Master Mix | ThermoFisher | K0221 | qPCR master mix |
| Synthetic Oviductal Fluid with HEPES (HSOF) | |||
| ThermoPlate | Tokai Hit | TPi-SMZSSX | Heating stage |
References
- Loi, P., Modlinski, J. A., Ptak, G. Interspecies somatic cell nuclear transfer: A salvage tool seeking first aid. Theriogenology. 76 (2), 217-228 (2011).
- Wani, N. A., Vettical, B. S., Hong, S. B. First cloned Bactrian camel (camelus bactrianus) calf produced by interspecies somatic cell nuclear transfer: A step towards preserving the critically endangered wild Bactrian camels. PLOS ONE. 12 (5), 0177800 (2017).
- Oh, H. J., et al. Cloning endangered gray wolves (canis lupus) from somatic cells collected postmortem. Theriogenology. 70 (4), 638-647 (2008).
- Srirattana, K., et al. Full-term development of gaur-bovine interspecies somatic cell nuclear transfer embryos: Effect of trichostatin a treatment. Cellular Reprogramming. 14 (3), 248-257 (2012).
- Kwon, D. K., et al. Blastocysts derived from adult fibroblasts of a rhesus monkey (macaca mulatta) using interspecies somatic cell nuclear transfer. Zygote. 19 (3), 199-204 (2011).
- Lee, E., et al. Production of cloned sei whale (Balaenoptera borealis) embryos by interspecies somatic cell nuclear transfer using enucleated pig oocytes. Journal of Veterinary Science. 10 (4), 285 (2009).
- Lorthongpanich, C., Laowtammathron, C., Chan, A. W., Kedutat-Cairns, M., Parnpai, R. Development of interspecies cloned monkey embryos reconstructed with bovine enucleated oocytes. Journal of Reproduction and Development. 54 (5), 306-313 (2008).
- Hong, S. G., et al. Production of transgenic canine embryos using interspecies somatic cell nuclear transfer. Zygote. 20 (1), 67-72 (2011).
- Stewart, J. B., Chinnery, P. F. The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: Implications for human health and disease. Nature Reviews Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).
- Takeda, K. Mitochondrial DNA transmission and confounding mitochondrial influences in cloned cattle and pigs. Reproductive Medicine and Biology. 12 (2), 47-55 (2013).
- Lanza, R. P., et al. Cloning of an endangered species (Bos Gaurus) using interspecies nuclear transfer. Cloning. 2 (2), 79-90 (2000).
- Evans, M. J., et al. Mitochondrial DNA genotypes in nuclear transfer-derived cloned sheep. Nature Genetics. 23 (1), 90-93 (1999).
- Meirelles, F. V., et al. Complete replacement of the mitochondrial genotype in a Bos indicus calf reconstructed by nuclear transfer to a Bos taurus oocyte. Genetics. 158 (1), 351-356 (2001).
- Beyhan, Z., Iager, A. E., Cibelli, J. B. Interspecies nuclear transfer: Implications for embryonic stem cell biology. Cell Stem Cell. 1 (5), 502-512 (2007).
- Lagutina, I., Fulka, H., Lazzari, G., Galli, C. Interspecies somatic cell nuclear transfer: advancements and problems. Cellular Reprogramming. 15 (5), 374-384 (2013).
- Jiang, Y., et al. Interspecies somatic cell nuclear transfer is dependent on compatible mitochondrial DNA and reprogramming factors. PLoS ONE. 6 (4), 14805 (2011).
- Chiaratti, M. R., et al. Embryo mitochondrial DNA depletion is reversed during early embryogenesis in cattle. Biology of Reproduction. 82 (1), 76-85 (2010).
- Spikings, E. C., Alderson, J., John, J. C. Regulated mitochondrial DNA replication during oocyte maturation is essential for successful porcine embryonic development. Biology of Reproduction. 76 (2), 327-335 (2007).
- Cagnone, G. L., et al. Restoration of normal embryogenesis by mitochondrial supplementation in pig oocytes exhibiting mitochondrial DNA deficiency. Scientific Reports. 6 (1), 1-15 (2016).
- Spikings, E. C., Alderson, J., John, J. C. Regulated mitochondrial DNA replication during oocyte maturation is essential for successful porcine embryonic development. Biology of Reproduction. 76 (2), 327-335 (2007).
- Ferreira, A. F., et al. Does supplementation with mitochondria improve oocyte competence? A systematic review. Reproduction. 161 (3), 269-287 (2021).
- Bhat, M. H., et al. Live birth of a pashmina goat kid after transfer of handmade cloned embryos. Journal of Reproduction and Development. , (2019).
- Tecirlioglu, R. T., et al. Birth of a cloned calf derived from a vitrified hand-made cloned embryo. Reproduction, Fertility and Development. 15 (7), 361 (2003).
- Zhang, P., et al. Handmade cloned transgenic piglets expressing the nematode fat-1 gene. Cellular Reprogramming. 14 (3), 258-266 (2012).
- Zhang, P., et al. Handmade cloned transgenic sheep rich in omega-3 fatty acids. PLOS ONE. 8 (2), 55941 (2013).
- Lagutina, I., et al. Somatic cell nuclear transfer in horses: Effect of oocyte morphology, embryo reconstruction method and donor cell type. Reproduction. 130 (4), 559-567 (2005).
- Chiaratti, M. R., et al. Embryo mitochondrial DNA depletion is reversed during early embryogenesis in cattle. Biology of Reproduction. 82 (1), 76-85 (2010).
- Hosseini, S. M., et al. and efficient method of manual oocyte enucleation using a pulled pasteur pipette. In Vitro Cellular and Developmental Biology – Animal. 49 (8), 569-575 (2013).
- Zampolla, T., Spikings, E., Rawson, D., Zhang, T. Cytoskeleton proteins F-actin and tubulin distribution and interaction with mitochondria in the granulosa cells surrounding stage III zebrafish (danio rerio) oocytes. Theriogenology. 76 (6), 1110-1119 (2011).
- International Union for Conservation of Nature. The IUCN Red List of Threatened Species. International Union for Conservation of Nature. , (2021).
- Berg, D. K., Li, C., Asher, G., Wells, D. N., Oback, B. Red deer cloned from antler stem cells and their differentiated progeny. Biology of Reproduction. 77 (3), 384-394 (2007).
- Gómez, M. C., et al. Birth of African wildcat cloned kittens born from domestic cats. Cloning and Stem Cells. 6 (3), 247-258 (2004).
- Lanza, R. P., et al. Cloning of an endangered species (Bos gaurus) using interspecies nuclear transfer. Cloning. 2 (2), 79-90 (2000).
