생체 내에서 인간 면역 반응을 조작하기 위한 이종이식 피부 모델
Summary
본 프로토콜은 비비만 당뇨병(NOD)-scid 인터루킨-2 감마사슬 수용체(NSG) 마우스에 인간 피부를 이식하는 방법을 설명합니다. 이식을 위한 인간 피부의 준비, 이식을 위한 마우스의 준비, 분할 두께의 인간 피부의 이식 및 이식 후 회복 절차에 대한 자세한 설명이 보고서에 포함되어 있습니다.
Abstract
인간 기증자 피부를 면역결핍 마우스 숙주에 이식하는 인간 피부 이종이식 모델은 피부 면역학의 중개 연구를 위한 중요한 옵션입니다. 뮤린 및 인간의 피부는 해부학적 및 면역 세포 조성에서 실질적으로 상이하다. 따라서 전통적인 마우스 모델은 피부과 연구 및 약물 발견에 한계가 있습니다. 그러나 성공적인 이종 이식은 기술적으로 어렵고 이식 및 숙주 생존을 위해 최적의 표본 및 마우스 이식 부위 준비가 필요합니다. 본 프로토콜은 마우스 상에 인간 피부를 이식하기 위한 최적화된 기술을 제공하고 다운스트림 실험 목표에 필요한 고려사항을 논의한다. 이 보고서는 인간 기증자 피부 샘플의 적절한 준비, 수술 설정의 조립, 마우스 및 수술 부위 준비, 피부 이식 및 수술 후 모니터링을 설명합니다. 이러한 방법을 준수하면 수술 후 6 주 이상 이종 이식편을 유지할 수 있습니다. 아래에 설명된 기술은 엔지니어링 제어, 멸균 기술 및 수술 전 및 수술 후 컨디셔닝의 개발로 인해 최대 이식 효율성을 허용합니다. 이종이식 모델의 적절한 성능은 인간 피부의 실험적 특성화 및 생체내 화합물의 전임상 시험을 위한 수명이 긴 인간 피부 이식편 샘플을 초래합니다.
Introduction
마우스 모델은 인간 생물학 및 질병에 대한 추론을 위해 자주 사용되며, 부분적으로는 실험적 재현성과 유전자 조작 능력 때문입니다. 그러나, 마우스 생리학은 인간 장기 시스템, 특히 피부를 완전히 재현하지 못하므로,약물 개발에서 전임상 모델로 사용하기에는 한계가 있다1. 마우스와 인간 피부의 해부학적 차이에는 상피 두께와 구조의 차이, 쥐 에크린 땀샘의 부족, 모발 순환의 변화가포함됩니다2. 또한, 면역계의 선천적 팔과 적응 팔은 두 종 사이에서 갈라진다3. 마우스 피부는 수지상 표피 T 세포 (DETC)의 독특한 면역 집단을 함유하고, 진피 γδ T 세포의 풍부함이 더 많으며, 인간 조직과 비교하여 면역 세포 하위 집합 국소화가 다양합니다4. 따라서 인간 피부 생물학 및 염증에 관한 실험 결과는 인간 조직을 사용한 검증의 이점을 얻습니다. 시험관 내 및 오가노이드 배양 시스템은 인체 조직을 연구하기 위해 널리 활용되는 도구이지만, 이러한 시스템은 부재하거나 불완전한 면역 재구성 및 말초 혈관구조에 대한 연결 부족으로 인해제한됩니다5. 인간화 이종이식 피부 이식 모델은 생체 내에서 인간 조직에서 면역 및 비면역 경로의 치료적 또는 생물학적 조작을 허용하는 것을 목표로 합니다.
인간 피부 이종이식 모델은 피부 생리학 및 약리학을 연구하고, 면역 거부 반응 및 반응을 분석하고, 인간 피부암 메커니즘을 해부하고, 피부 질환 및상처 치유를 이해하는 데 활용되었습니다6. 피부 연구의 여러 분야에 적용 할 수 있지만, 이종 이식 모델은 시험관 내 연구보다 처리량이 낮고 마우스 모델에 사용되는 유전자 조작의 용이성이 부족합니다. 이 모델 내의 시점은 몇 주에서 몇 달까지 다양할 수 있으며 성공적인 이식을 위해서는 이러한 수술을 수행하기 위한 적절한 시설과 장비가 필요합니다. 그러나 이종이식 모델은 실험에 생물학적 및 생리학적 맥락을 제공하는 반면, 조직 외식편과 같은 유기체 배양 시스템은 종종 특정 시간 간격으로 외인성 신호와 같은 무수한 움직이는 부분을 복제해야합니다7. 따라서 이 모델은 시험관 내 및 마우스 모델 내에서 관찰된 결과를 추가로 검증하거나 생물학적으로 실현 가능하지 않은 작업에 가장 잘 활용됩니다. 이종이식 모델의 적절한 사용은 생체 내에서 온전한 인간 조직을 연구하고 조작할 수 있는 독특한 기회를 제공합니다.
이종이식 피부 이식 모델의 최적화는 시간이 지남에 따라 이식편 무결성을 보존하기 위해 수십 년의 연구에 의존해 왔습니다. 이 과정에서 중요한 것은 B 및 T 적응 면역 세포, 기능성 NK 세포가 부족하고 대 식세포 및 수지상 세포8이 결핍 된 비 비만 당뇨병 (NOD) – scid 인터루킨 -2 감마 사슬 수용체 (NSG) 마우스를 활용하는 것입니다. 이들 NSG 숙주의 면역결핍 성질은 인간 조혈 세포, 환자-유래 암, 및 피부 8,9,10의 이식을 허용한다. 이러한 면역억제 숙주 환경에도 불구하고, 이식 성공10을 위해서는 항-GR1 투여에 의한 마우스 호중구 면역 반응의 추가의 억제가 필요하다. 손상되지 않은 조직을 이식하는 데 있어 주요 장애물은 감염, 거부 및 이식편으로의 혈류 재설정의 어려움이며 때로는 피부 및 표피 완전성의 손실로 이어집니다11. 항-FR1의 투여 및 적절한 이식 깊이의 사용을 포함하는 기술은 이식편 생존을 개선한다10. 세심한 최적화를 통해 NSG 마우스에서 인간 이종 이식 피부 이식을 90 % -100 % 범위의 높은 효율성과 생존율로 수행 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
마우스 이종이식 피부 이식 모델은 생체내 설정14에서 인간 피부 면역 반응을 기계적으로 해부하는 핵심 기술이다. 성공적인 피부 이종 이식 이식은 마우스 및 피부 표본 및 마우스의 적절한 준비와 무균 설치류 수술 방법15의 준수에 달려 있습니다. 배지(예: 멸균 식염수)의 차가운 온도에서 피부 샘플을 급속 냉각 및 적절하게 보관하는 것은 이식 전에 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 TRex Bio의 후원 연구 계약과 NIH (1R01AR075864-01A1)의 보조금으로 부분적으로 자금을 지원했습니다. JMM은 암 연구 학회 (보조금 26005)의 지원을 받고 있습니다. 우리는 NIH P30 DK063720, S10 1S10OD021822-01 및 S10 1S10OD018040-01에 의해 부분적으로 지원되는 Parnassus 유세포 분석 코어를 인정합니다.
Materials
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | SF100-20 | Fixative for histology |
| 3M Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | surgical glue |
| Alexa 700 CD45 monoclonal antibody (Clone 30F11) | Thermo Fischer | 56-0451-82 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Anti-GR1 clone RB6-8C5 | BioXcell | BE0075 | Anti-rejection |
| APC mouse anti-human CD25 (Clone 2A3) | BD Biosciences | 340939 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| APC-eFluor 780 anti-human HLA-DR (Clone LN3) | eBioscience | 47-9956-42 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Autoclave pouches | VWR | 89140-800 | For autoclaving tools and paper towels |
| Brilliant Violet 60 anti-human CD4 antibody (Clone OKT4 | Biolegend | 317438 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Brilliant Violet 65 anti-human CD8a antibody (Clone RPA-T8) | Biolegend | 301042 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Brilliant Violet 711 anti-human CD3 antibody (Clone OKT3) | Biolegend | 317328 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Buprenex 0.3 mg/mL | Covetrus | 059122 | Analgesia |
| Carprofen 50 mg/mL | Zoetis | NADA # 141-199 | Analgesia |
| Collagenase Type IV | Worthington | 4188 | Skin digestion |
| D42 Dermatome blade | Humeca | 5.D42BL10 | dermatome (1 blade per sample) |
| Dermatome D42 | Humeca | 4.D42 | dermatome |
| Disposable Scalpel | Bard-Parker | 371610 | skin preparation |
| Dissecting T-Pins; 1-1/2 inch, 1000/CS 1.5 | Cole-Parmer | UX-10915-03 | To pin skin specimen for dermatome |
| Dissection scissors | medicon | 02.04.10 | sample preparation and mouse dissection |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25-1G | Skin digestion |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent | eBioscience | 00-5521-00 | Flow cytometry analysis: Cell Fixation and Permeabilization |
| eFluor-450 FOXP3 monoclonal antibody (Clone PCH101) | eBioscience | 48-4776-42 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| Electric clippers | Kent | CL8787-KIT | hair removal |
| Epredia Shandon Instant Eosin | Fisher Scientific | 6765040 | H&E |
| Epredia Shandon Instant Hematoxylin | Fisher Scientific | 6765015 | H&E |
| FITC anti-human CD45 (Clone HI30) | Tonbo Biosciences | 35-0459-T100 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Forceps | medicon | 07.60.07 | sample preparation and mouse dissection |
| Gauze | Fisherbrand | 22-362-178 | Sample preparation |
| Heating lamp | Morganville Scientific | HL0100 | Post-surgical care |
| Heating pads 4" x 10" | Pristech | 20415 | Surgical heat supply |
| Insulin 1cc 12.7 mm syringes | BD | 329410 | drug administration |
| Isoflurane | United States Pharmacopeia (USP) | NDC 66794-013-25 | Anesthesia |
| Isoflurane machine | VetEquip | 911103 | Anesthesia |
| Nair for Men | Nair | 10022600588556 | hair removal |
| Neomycin and Polymyxin Bisulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic ointment | Dechra | NDC 17478-235-35 | eye ointment to prevent drying |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 005557 | Mice |
| Paper towels | Kleenex | 100848 | May be autoclaved for sterile surfaces |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | Semitransparent sealing film |
| PE mouse anti-human CD127 (Clone HIL-7R-M21) | BD Biosciences | 557938 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| PE-Cy-7 mouse anti-Ki-67 (Clone B56) | BD Biosciences | 561283 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| PerCP-eFluor-710 CD152 (CTLA-4) monoclonal antibody (Clone 14D3) | eBioscience | 46-1529-42 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| Permeabilization Buffer 10x | eBioscience | 00-8333-56 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining buffer |
| Petri Dish 150 mm | Corning | 430597 | Sample storage |
| Plastic Wrap | Fisherbrand | 22-305-654 | Site preparation |
| Providone-Iodine Swab stick | PDI | S41350 | Site sterilization |
| Soft-Feed and Oral Hydration (Napa Nectar) | Se Lab Group Inc | NC9066511 | For supplementing poorly recovering mice post-surgery |
| Specimen Collection Cups | Fisher Scientific | 22-150-266 | sample storage |
| Sterile alcohol prep pad | Fisherbrand | 22-363-750 | skin preparation |
| Sterile PBS | Gibco | 14190-144 | Media for sample storage |
| Sterile saline | Hospira | NDC 0409-4888-02 | For drug dilution |
| Tegaderm Film 4” x 43/4” | 3M | 1626 | transparent film wound dressing |
| Vaseline Petrolatum Gauze 3” x 8” | Kendall | 414600 | wound dressing |
| Violet 510 Ghost Dye | Tonbo Biosciences | 13-0870-T100 | Flow cytometry analysis: Viability dye |
References
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