نموذج Xenograft للجلد للتلاعب بالاستجابات المناعية البشرية في الجسم الحي
Summary
يصف البروتوكول الحالي كيفية تطعيم جلد الإنسان على الفئران غير المصابة بالسمنة والسكرية (NOD) -scid interleukin-2 مستقبلات سلسلة غاما (NSG). يتضمن التقرير وصفا مفصلا لإعداد جلد الإنسان للزراعة ، وإعداد الفئران للزراعة ، وزرع جلد الإنسان ذي السماكة المنقسمة ، وإجراء التعافي بعد الزرع.
Abstract
يعد نموذج xenograft للجلد البشري ، حيث يتم زرع جلد متبرع بشري على مضيف فأر يعاني من نقص المناعة ، خيارا مهما للبحث الانتقالي في علم المناعة الجلدي. يختلف جلد الفئران والإنسان اختلافا كبيرا في التشريح وتكوين الخلايا المناعية. لذلك ، فإن نماذج الماوس التقليدية لها قيود على أبحاث الأمراض الجلدية واكتشاف الأدوية. ومع ذلك ، فإن عمليات الزرع الخارجية الناجحة تمثل تحديا تقنيا وتتطلب إعداد مثالي لموقع الكسب غير المشروع للعينات والفئران من أجل الكسب غير المشروع وبقاء المضيف. يوفر البروتوكول الحالي تقنية محسنة لزرع جلد الإنسان على الفئران ويناقش الاعتبارات اللازمة للأهداف التجريبية النهائية. يصف هذا التقرير التحضير المناسب لعينة جلد متبرع بشري ، وتجميع الإعداد الجراحي ، وإعداد الفئران والموقع الجراحي ، وزرع الجلد ، ومراقبة ما بعد الجراحة. يسمح الالتزام بهذه الطرق بالحفاظ على الطعوم الخارجية لأكثر من 6 أسابيع بعد الجراحة. تسمح التقنيات الموضحة أدناه بأقصى قدر من كفاءة التطعيم بسبب تطوير الضوابط الهندسية والتقنية المعقمة والتكييف قبل الجراحة وبعدها. ينتج عن الأداء المناسب لنموذج xenograft عينات طعم جلد الإنسان طويلة العمر للتوصيف التجريبي لجلد الإنسان والاختبار قبل السريري للمركبات في الجسم الحي.
Introduction
كثيرا ما تستخدم نماذج الفئران لعمل استنتاجات حول البيولوجيا البشرية والمرض ، ويرجع ذلك جزئيا إلى قابليتها للتكاثر التجريبي وقدرتها على التلاعب الجيني. ومع ذلك ، فإن فسيولوجيا الفئران لا تلخص تماما أنظمة الأعضاء البشرية ، وخاصة الجلد ، وبالتالي لديها قيود للاستخدام كنموذج قبل سريري في تطوير الأدوية1. تشمل الاختلافات التشريحية بين جلد الفأر والإنسان الاختلافات في سمك الظهارة والهندسة المعمارية ، ونقص الغدد العرقية المفرزة للفئران ، والاختلافات في دورة الشعر2. علاوة على ذلك ، فإن كلا من الأذرع الفطرية والتكيفية للجهاز المناعي متباعدة بين النوعين3. يحتوي جلد الفأر على مجموعة مناعية فريدة من الخلايا التائية للبشرة المتغصنة (DETCs) ، ولديه وفرة أعلى من الخلايا التائية الجلدية γδ ، ويختلف في توطين المجموعة الفرعية للخلايا المناعية مقارنة بالأنسجة البشرية4. لذلك ، تستفيد النتائج التجريبية المتعلقة ببيولوجيا الجلد البشري والالتهاب من التحقق من صحة الأنسجة البشرية. في حين أن أنظمة الزراعة العضوية والمختبرية تستخدم على نطاق واسع أدوات لدراسة الأنسجة البشرية ، فإن هذه الأنظمة محدودة بسبب إعادة تكوين المناعة الغائبة أو غير المكتملة وعدم الاتصال بالأوعية الدموية الطرفية5. يهدف نموذج زرع الجلد xenograft المتوافق مع البشر إلى السماح بالتلاعب العلاجي أو البيولوجي للمسارات المناعية وغير المناعية في الأنسجة البشرية في الجسم الحي.
تم استخدام نموذج xenograft للجلد البشري لدراسة فسيولوجيا الجلد وعلم الأدوية ، وتحليل الرفض والاستجابات المناعية ، وتشريح آليات سرطان الجلد البشري ، وفهم الأمراض الجلدية والتئام الجروح6. في حين أن نموذج xenograft قابل للتطبيق على مجالات متعددة من أبحاث الجلد ، إلا أنه يحتوي على إنتاجية أقل من الدراسات المختبرية ويفتقر إلى سهولة التلاعب الجيني المستخدم في نماذج الفئران. قد تتراوح النقاط الزمنية ضمن هذا النموذج من أسابيع إلى أشهر ، ويتطلب التطعيم الناجح مرافق ومعدات مناسبة لإجراء هذه العمليات الجراحية. ومع ذلك ، فإن نموذج xenograft يوفر السياق البيولوجي والفسيولوجي للتجارب ، في حين أن أنظمة الزراعة العضوية ، مثل explants الأنسجة ، غالبا ما تتطلب تكرار عدد لا يحصى من الأجزاء المتحركة ، مثل الإشارات الخارجية ، في فترات زمنية محددة7. لذلك ، يتم استخدام هذا النموذج بشكل أفضل للتحقق من صحة النتائج التي لوحظت في المختبر وداخل نماذج الفئران ، أو للعمل غير الممكن بيولوجيا بطريقة أخرى. يوفر الاستخدام المناسب لنموذج xenograft فرصة فريدة لدراسة ومعالجة الأنسجة البشرية السليمة في الجسم الحي.
اعتمد تحسين نموذج زراعة الجلد xenograft على عقود من البحث للحفاظ على سلامة الكسب غير المشروع بمرور الوقت. من الأهمية بمكان لهذه العملية استخدام فأر مستقبلات سلسلة جاما (NSG) غير البدين (NOD) -scid interleukin-2 ، والذي يفتقر إلى الخلايا المناعية التكيفية B و T ، والخلايا القاتلة الطبيعية الوظيفية ، ولديه أوجه قصور في الخلايا البلعمية والخلايا المتغصنة8. تسمح الطبيعة التي تعاني من نقص المناعة لمضيفات NSG هذه بزرع الخلايا المكونة للدم البشرية والسرطانات المشتقة من المريض والجلد8،9،10. على الرغم من هذه البيئة المضيفة المثبطة للمناعة ، فإن القمع الإضافي للاستجابات المناعية للعدلات في الفئران عن طريق الإدارة المضادة ل GR1 ضروري لنجاح الكسب غير المشروع10. تتمثل الحواجز الرئيسية في زرع الأنسجة السليمة في العدوى والرفض وصعوبة إعادة تدفق الدم إلى الكسب غير المشروع ، مما يؤدي في بعض الأحيان إلى فقدان سلامة الجلد والبشرة11. التقنيات بما في ذلك إعطاء مضاد FR1 واستخدام عمق الكسب غير المشروع المناسب تحسين بقاء الكسب غير المشروع10. يتيح التحسين الدقيق إجراء عمليات زرع جلد xenograft البشرية على فئران NSG بكفاءة عالية ومعدلات بقاء ، تتراوح من 90٪ إلى 100٪.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعد نموذج زرع جلد الفأر xenograft تقنية رئيسية لتشريح الاستجابات المناعية لجلد الإنسان ميكانيكيا في وضع في الجسم الحي 14. تعتمد عمليات زرع الطعم الأجنبي الناجحة على التحضير المناسب للفئران وعينات الجلد والفئران والالتزام بطرق جراحة القوارض المعقمة15. يعد التبري?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل جزئيا من خلال اتفاقيات البحث التي ترعاها TRex Bio والمنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (1R01AR075864-01A1). يتم دعم JMM من قبل جمعية أبحاث السرطان (منحة 26005). نحن نعترف بنواة قياس التدفق الخلوي Parnassus المدعومة جزئيا بمنح NIH P30 DK063720 و S10 1S10OD021822-01 و S10 1S10OD018040-01.
Materials
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | SF100-20 | Fixative for histology |
| 3M Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | surgical glue |
| Alexa 700 CD45 monoclonal antibody (Clone 30F11) | Thermo Fischer | 56-0451-82 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Anti-GR1 clone RB6-8C5 | BioXcell | BE0075 | Anti-rejection |
| APC mouse anti-human CD25 (Clone 2A3) | BD Biosciences | 340939 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| APC-eFluor 780 anti-human HLA-DR (Clone LN3) | eBioscience | 47-9956-42 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Autoclave pouches | VWR | 89140-800 | For autoclaving tools and paper towels |
| Brilliant Violet 60 anti-human CD4 antibody (Clone OKT4 | Biolegend | 317438 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Brilliant Violet 65 anti-human CD8a antibody (Clone RPA-T8) | Biolegend | 301042 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Brilliant Violet 711 anti-human CD3 antibody (Clone OKT3) | Biolegend | 317328 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Buprenex 0.3 mg/mL | Covetrus | 059122 | Analgesia |
| Carprofen 50 mg/mL | Zoetis | NADA # 141-199 | Analgesia |
| Collagenase Type IV | Worthington | 4188 | Skin digestion |
| D42 Dermatome blade | Humeca | 5.D42BL10 | dermatome (1 blade per sample) |
| Dermatome D42 | Humeca | 4.D42 | dermatome |
| Disposable Scalpel | Bard-Parker | 371610 | skin preparation |
| Dissecting T-Pins; 1-1/2 inch, 1000/CS 1.5 | Cole-Parmer | UX-10915-03 | To pin skin specimen for dermatome |
| Dissection scissors | medicon | 02.04.10 | sample preparation and mouse dissection |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25-1G | Skin digestion |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent | eBioscience | 00-5521-00 | Flow cytometry analysis: Cell Fixation and Permeabilization |
| eFluor-450 FOXP3 monoclonal antibody (Clone PCH101) | eBioscience | 48-4776-42 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| Electric clippers | Kent | CL8787-KIT | hair removal |
| Epredia Shandon Instant Eosin | Fisher Scientific | 6765040 | H&E |
| Epredia Shandon Instant Hematoxylin | Fisher Scientific | 6765015 | H&E |
| FITC anti-human CD45 (Clone HI30) | Tonbo Biosciences | 35-0459-T100 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Forceps | medicon | 07.60.07 | sample preparation and mouse dissection |
| Gauze | Fisherbrand | 22-362-178 | Sample preparation |
| Heating lamp | Morganville Scientific | HL0100 | Post-surgical care |
| Heating pads 4" x 10" | Pristech | 20415 | Surgical heat supply |
| Insulin 1cc 12.7 mm syringes | BD | 329410 | drug administration |
| Isoflurane | United States Pharmacopeia (USP) | NDC 66794-013-25 | Anesthesia |
| Isoflurane machine | VetEquip | 911103 | Anesthesia |
| Nair for Men | Nair | 10022600588556 | hair removal |
| Neomycin and Polymyxin Bisulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic ointment | Dechra | NDC 17478-235-35 | eye ointment to prevent drying |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 005557 | Mice |
| Paper towels | Kleenex | 100848 | May be autoclaved for sterile surfaces |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | Semitransparent sealing film |
| PE mouse anti-human CD127 (Clone HIL-7R-M21) | BD Biosciences | 557938 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| PE-Cy-7 mouse anti-Ki-67 (Clone B56) | BD Biosciences | 561283 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| PerCP-eFluor-710 CD152 (CTLA-4) monoclonal antibody (Clone 14D3) | eBioscience | 46-1529-42 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| Permeabilization Buffer 10x | eBioscience | 00-8333-56 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining buffer |
| Petri Dish 150 mm | Corning | 430597 | Sample storage |
| Plastic Wrap | Fisherbrand | 22-305-654 | Site preparation |
| Providone-Iodine Swab stick | PDI | S41350 | Site sterilization |
| Soft-Feed and Oral Hydration (Napa Nectar) | Se Lab Group Inc | NC9066511 | For supplementing poorly recovering mice post-surgery |
| Specimen Collection Cups | Fisher Scientific | 22-150-266 | sample storage |
| Sterile alcohol prep pad | Fisherbrand | 22-363-750 | skin preparation |
| Sterile PBS | Gibco | 14190-144 | Media for sample storage |
| Sterile saline | Hospira | NDC 0409-4888-02 | For drug dilution |
| Tegaderm Film 4” x 43/4” | 3M | 1626 | transparent film wound dressing |
| Vaseline Petrolatum Gauze 3” x 8” | Kendall | 414600 | wound dressing |
| Violet 510 Ghost Dye | Tonbo Biosciences | 13-0870-T100 | Flow cytometry analysis: Viability dye |
References
- Zomer, H. D., Trentin, A. G. Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research. Journal of Dermatological Science. 90 (1), 3-12 (2018).
- Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. Surgical approaches to create murine models of human wound healing. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 969618 (2011).
- Mestas, J., Hughes, C. C. W. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. The Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- Pasparakis, M., Haase, I., Nestle, F. O. Mechanisms regulating skin immunity and inflammation. Nature Reviews Immunology. 14 (5), 289-301 (2014).
- Sun, H., Zhang, Y. -. X., Li, Y. -. M. Generation of skin organoids: potential opportunities and challenges. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 3176 (2021).
- Cristóbal, L., et al. Mouse models for human skin transplantation: a systematic review. Cells Tissues Organs. 210 (4), 250-259 (2021).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/γcnull mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Meraz, I. M., et al. An improved patient-derived xenograft humanized mouse model for evaluation of lung cancer immune responses. Cancer Immunology Research. 7 (8), 1267-1279 (2019).
- Racki, W. J., et al. NOD-scid IL2rgamma(null) mouse model of human skin transplantation and allograft rejection. Transplantation. 89 (5), 527-536 (2010).
- Meehan, G. R., et al. Developing a xenograft model of human vasculature in the mouse ear pinna. Scientific Reports. 10 (1), 2058 (2020).
- Gokkaya, A., et al. Skin graft storage in platelet rich plasma (PRP). Dermatologic Therapy. 33 (1), 13178 (2020).
- . The Humeca D42 and D80 battery operated cordless dermatomes Available from: https://www.youtube.com/watch?v=YCRowX-TdA (2021)
- Rodriguez, R. S., et al. Memory regulatory T cells reside in human skin. The Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1027-1036 (2014).
- Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A. Techniques in rodent aseptic surgery. Current Protocols in Immunology. 82 (1), 12-14 (2008).
- Karim, A. S., et al. Evolution of ischemia and neovascularization in a murine model of full thickness human wound healing. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 28 (6), 812-822 (2020).
- Ali, N., et al. Xenogeneic graft-versus-host-disease in NOD-scid IL-2Rγnull mice display a T-effector memory phenotype. PloS One. 7 (8), 44219 (2012).
- Souci, L., Denesvre, C. 3D skin models in domestic animals. Veterinary Research. 52 (1), 21 (2021).
- Holtkamp, S. J., et al. Circadian clocks guide dendritic cells into skin lymphatics. Nature Immunology. 22 (11), 1375-1381 (2021).
