Summary

Modelo de pele de xenoenxerto para manipular respostas imunes humanas in vivo

Published: June 29, 2022
doi:

Summary

O presente protocolo descreve como enxertar pele humana em camundongos diabéticos não obesos (NOD)-scid interleucina-2 receptor de cadeia gama (NSG) camundongos. Uma descrição detalhada da preparação da pele humana para transplante, preparação de camundongos para transplante, transplante de pele humana de espessura dividida e procedimento de recuperação pós-transplante estão incluídas no relatório.

Abstract

O modelo de xenoenxerto de pele humana, no qual a pele do doador humano é transplantada para um hospedeiro de camundongo imunodeficiente, é uma opção importante para a pesquisa translacional em imunologia da pele. A pele murina e humana diferem substancialmente na anatomia e composição das células imunes. Portanto, os modelos tradicionais de camundongos têm limitações para a pesquisa dermatológica e a descoberta de medicamentos. No entanto, xenotransplantes bem-sucedidos são tecnicamente desafiadores e exigem uma preparação ideal do local do espécime e do enxerto de camundongo para a sobrevivência do enxerto e do hospedeiro. O presente protocolo fornece uma técnica otimizada para transplante de pele humana em camundongos e discute considerações necessárias para os objetivos experimentais a jusante. Este relatório descreve a preparação apropriada de uma amostra de pele de doador humano, montagem de uma configuração cirúrgica, preparação de camundongo e local cirúrgico, transplante de pele e monitoramento pós-cirúrgico. A adesão a esses métodos permite a manutenção de xenoenxertos por mais de 6 semanas após a cirurgia. As técnicas descritas abaixo permitem a máxima eficiência do enxerto devido ao desenvolvimento de controles de engenharia, técnica estéril e condicionamento pré e pós-cirúrgico. O desempenho adequado do modelo de xenoenxerto resulta em amostras de enxerto de pele humana de longa duração para caracterização experimental de pele humana e testes pré-clínicos de compostos in vivo.

Introduction

Modelos de camundongos são frequentemente usados para fazer inferências sobre a biologia humana e a doença, em parte devido à sua reprodutibilidade experimental e capacidade de manipulação genética. No entanto, a fisiologia do camundongo não recapitula completamente os sistemas de órgãos humanos, particularmente a pele, e, portanto, tem limitações para uso como modelo pré-clínico no desenvolvimento de fármacos1. As diferenças anatômicas entre a pele de camundongos e humanos incluem diferenças nas espessuras e arquitetura epitelial, falta de glândulas sudoríparas écrinas murinas e variações no ciclo capilar2. Além disso, tanto os braços inato quanto o adaptativo do sistema imunológico são divergentes entre as duas espécies3. A pele de camundongo contém uma população imune única de células T epidérmicas dendríticas (DETCs), tem uma maior abundância de células T γδ dérmicas e varia na localização do subconjunto de células imunes em comparação com o tecido humano4. Portanto, os achados experimentais sobre a biologia da pele humana e a inflamação se beneficiam da validação com tecido humano. Embora os sistemas de cultura in vitro e organoides sejam ferramentas amplamente utilizadas para o estudo do tecido humano, esses sistemas são limitados pela reconstituição imune ausente ou incompleta e pela falta de conexão com a vasculatura periférica5. O modelo humanizado de transplante de pele de xenoenxerto visa permitir a manipulação terapêutica ou biológica de vias imunes e não imunes em tecidos humanos in vivo.

O modelo de xenoenxerto de pele humana tem sido utilizado para estudar a fisiologia e farmacologia da pele, analisar a rejeição e as respostas imunes, dissecar os mecanismos do câncer de pele humano e entender as doenças de pele e a cicatrização de feridas6. Embora aplicável a vários campos de pesquisa da pele, o modelo de xenoenxerto tem menor rendimento do que os estudos in vitro e não tem a facilidade de manipulação genética empregada em modelos de camundongos. Os pontos de tempo dentro deste modelo podem variar de semanas a meses, e o enxerto bem-sucedido requer instalações e equipamentos apropriados para realizar essas cirurgias. No entanto, o modelo de xenoenxerto fornece contexto biológico e fisiológico aos experimentos, enquanto os sistemas de cultura organoides, como os explantes de tecidos, muitas vezes requerem a replicação de uma miríade de partes móveis, como sinais exógenos, em intervalos de tempo específicos7. Portanto, este modelo é melhor utilizado para validar ainda mais os achados observados in vitro e dentro de modelos de camundongos, ou para trabalhos que de outra forma não são biologicamente viáveis. O uso apropriado do modelo de xenoenxerto oferece uma oportunidade única para estudar e manipular o tecido humano intacto in vivo.

A otimização do modelo de transplante de pele de xenoenxerto tem contado com décadas de pesquisa para preservar a integridade do enxerto ao longo do tempo. Crítico para esse processo é a utilização do camundongo receptor de cadeia gama (NSG) não obeso diabético (NOD) e scid interleucina-2, que não possui células imunes adaptativas B e T, células NK funcionais e tem deficiências em macrófagos e células dendríticas8. A natureza imunodeficiente desses hospedeiros NSG permite o transplante de células hematopoiéticas humanas, cânceres derivados de pacientes e pele 8,9,10. Apesar desse ambiente imunossupressor do hospedeiro, a supressão adicional das respostas imunes neutrofílicas de camundongos pela administração de anti-GR1 é necessária para o sucesso do enxerto10. Os principais obstáculos no transplante de tecido intacto são infecção, rejeição e dificuldade em restabelecer o fluxo sanguíneo para o enxerto, às vezes levando à perda da integridade dérmica e epidérmica11. Técnicas que incluem a administração de anti-FR1 e o uso de profundidade apropriada do enxerto melhoram a sobrevida do enxerto10. A otimização meticulosa possibilita a realização de transplantes de pele de xenoenxerto humano em camundongos NSG com alta eficiência e taxas de sobrevivência, variando de 90% a 100%.

Protocol

O presente estudo foi aprovado e realizado em conformidade com os protocolos UCSF IACUC (AN191105-01H) e IRB (13-11307). Amostras de pele, descartadas como parte de procedimentos cirúrgicos eletivos de rotina, como o reparo de hérnia, foram utilizadas para a presente pesquisa. As amostras de pele são desidentificadas e certificadas como Pesquisa Não Humana ou, se informações de identificação clínica forem necessárias para análises a jusante, os pacientes forneceram consentimento por escrito sob o protocolo IRB…

Representative Results

Xenoenxertos de pele humana foram realizados em camundongos NSG dentro de uma instalação animal de super-barreira. O sucesso foi definido pela sobrevida prolongada do enxerto e do rato e pela saúde comportamental dos camundongos pós-transplante. A baixa sobrevida durante a semana seguinte à cirurgia foi inicialmente observada como a maior barreira para o sucesso experimental, com até 50% dos camundongos necessitando de eutanásia. Melhorar a técnica estéril e melhor suporte das temperaturas corporais do rato dura…

Discussion

O modelo de transplante de pele de xenoenxerto de camundongo é uma técnica fundamental para dissecar mecanicamente as respostas imunes da pele humana em um ambiente in vivo 14. O sucesso dos transplantes de xenoenxerto de pele depende do preparo adequado de camundongos e espécimes de pele e camundongos e da adesão a métodos de cirurgia asséptica de roedores15. O resfriamento rápido e o armazenamento adequado de amostras de pele a temperaturas frias em meios …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado em parte por acordos de pesquisa patrocinados da TRex Bio e subsídios do NIH (1R01AR075864-01A1). A JMM é apoiada pela Cancer Research Society (subvenção 26005). Reconhecemos o Parnassus Flow Cytometry Core apoiado em parte pelas subvenções NIH P30 DK063720, S10 1S10OD021822-01 e S10 1S10OD018040-01.

Materials

10% Neutral Buffered Formalin Fisher SF100-20 Fixative for histology
3M Vetbond Tissue Adhesive 3M 1469SB surgical glue
Alexa 700 CD45 monoclonal antibody (Clone 30F11) Thermo Fischer 56-0451-82 Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Anti-GR1 clone RB6-8C5 BioXcell BE0075 Anti-rejection
APC mouse anti-human CD25  (Clone 2A3) BD Biosciences 340939 Flow cytometry analysis: Surface protein staining
APC-eFluor 780 anti-human HLA-DR (Clone LN3) eBioscience 47-9956-42 Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Autoclave pouches VWR  89140-800 For autoclaving tools and paper towels
Brilliant Violet 60 anti-human CD4 antibody (Clone OKT4 Biolegend 317438 Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Brilliant Violet 65 anti-human CD8a antibody (Clone RPA-T8) Biolegend 301042 Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Brilliant Violet 711 anti-human CD3 antibody (Clone OKT3) Biolegend 317328 Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Buprenex 0.3 mg/mL Covetrus 059122 Analgesia
Carprofen 50 mg/mL Zoetis NADA # 141-199 Analgesia
Collagenase Type IV Worthington 4188 Skin digestion
D42 Dermatome blade Humeca 5.D42BL10 dermatome (1 blade per sample)
Dermatome D42 Humeca 4.D42 dermatome
Disposable Scalpel Bard-Parker 371610 skin preparation
Dissecting T-Pins; 1-1/2 inch, 1000/CS 1.5 Cole-Parmer UX-10915-03 To pin skin specimen for dermatome
Dissection scissors medicon 02.04.10 sample preparation and mouse dissection
DNAse Sigma-Aldrich DN25-1G Skin digestion
eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent eBioscience 00-5521-00 Flow cytometry analysis: Cell Fixation and Permeabilization
eFluor-450 FOXP3 monoclonal antibody (Clone PCH101) eBioscience 48-4776-42 Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining
Electric clippers Kent CL8787-KIT hair removal
Epredia Shandon Instant Eosin Fisher Scientific 6765040 H&E
Epredia Shandon Instant Hematoxylin Fisher Scientific 6765015 H&E
FITC anti-human CD45 (Clone HI30) Tonbo Biosciences 35-0459-T100 Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Forceps  medicon 07.60.07 sample preparation and mouse dissection
Gauze Fisherbrand 22-362-178 Sample preparation
Heating lamp Morganville Scientific HL0100 Post-surgical care
Heating pads 4" x 10" Pristech 20415 Surgical heat supply
Insulin 1cc 12.7 mm syringes BD 329410 drug administration
Isoflurane United States Pharmacopeia (USP)  NDC 66794-013-25 Anesthesia 
Isoflurane machine VetEquip 911103 Anesthesia
Nair for Men Nair ‎ 10022600588556 hair removal
Neomycin and Polymyxin Bisulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic ointment Dechra  NDC 17478-235-35 eye ointment to prevent drying
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice The Jackson Laboratory 005557 Mice
Paper towels Kleenex 100848 May be autoclaved for sterile surfaces
Parafilm Fisher Scientific 13-374-12 Semitransparent sealing film
PE mouse anti-human CD127 (Clone HIL-7R-M21) BD Biosciences 557938 Flow cytometry analysis: Surface protein staining
PE-Cy-7 mouse anti-Ki-67 (Clone B56) BD Biosciences 561283 Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining
PerCP-eFluor-710 CD152 (CTLA-4) monoclonal antibody (Clone 14D3) eBioscience 46-1529-42 Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining
Permeabilization Buffer 10x eBioscience 00-8333-56 Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining buffer
Petri Dish 150 mm Corning 430597 Sample storage
Plastic Wrap Fisherbrand 22-305-654 Site preparation
Providone-Iodine Swab stick PDI S41350 Site sterilization
Soft-Feed and Oral Hydration (Napa Nectar) Se Lab Group Inc NC9066511  For supplementing poorly recovering mice post-surgery
Specimen Collection Cups Fisher Scientific 22-150-266 sample storage
Sterile alcohol prep pad Fisherbrand 22-363-750 skin preparation
Sterile PBS Gibco 14190-144 Media for sample storage
Sterile saline Hospira NDC 0409-4888-02 For drug dilution
Tegaderm Film 4” x 43/4”  3M 1626 transparent film wound dressing
Vaseline Petrolatum Gauze 3” x 8”  Kendall 414600 wound dressing
Violet 510 Ghost Dye  Tonbo Biosciences 13-0870-T100 Flow cytometry analysis: Viability dye

References

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Cite This Article
Moss, M. I., Pauli, M., Moreau, J. M., Cohen, J. N., Rosenblum, M. D., Lowe, M. M. Xenograft Skin Model to Manipulate Human Immune Responses In Vivo. J. Vis. Exp. (184), e64040, doi:10.3791/64040 (2022).

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