Summary

Modello cutaneo di xenotrapianto per manipolare le risposte immunitarie umane in vivo

Published: June 29, 2022
doi:

Summary

Il presente protocollo descrive come innestare la pelle umana su topi del recettore della catena gamma (NSG) diabetici non obesi (NOD)-scid. Una descrizione dettagliata della preparazione della pelle umana per il trapianto, la preparazione di topi per il trapianto, il trapianto di pelle umana a spessore diviso e la procedura di recupero post-trapianto sono inclusi nella relazione.

Abstract

Il modello di xenotrapianto di pelle umana, in cui la pelle di un donatore umano viene trapiantata su un ospite di topo immunodeficiente, è un’opzione importante per la ricerca traslazionale in immunologia cutanea. La pelle murina e umana differiscono sostanzialmente nell’anatomia e nella composizione delle cellule immunitarie. Pertanto, i modelli murini tradizionali hanno limitazioni per la ricerca dermatologica e la scoperta di farmaci. Tuttavia, gli xenotrapianti di successo sono tecnicamente impegnativi e richiedono una preparazione ottimale del campione e del sito di innesto di topo per la sopravvivenza dell’innesto e dell’ospite. Il presente protocollo fornisce una tecnica ottimizzata per il trapianto di pelle umana sui topi e discute le considerazioni necessarie per gli obiettivi sperimentali a valle. Questo rapporto descrive la preparazione appropriata di un campione di pelle di donatore umano, l’assemblaggio di una configurazione chirurgica, la preparazione del topo e del sito chirurgico, il trapianto di pelle e il monitoraggio post-chirurgico. L’aderenza a questi metodi consente il mantenimento degli xenotrapianti per oltre 6 settimane dopo l’intervento. Le tecniche descritte di seguito consentono la massima efficienza dell’innesto grazie allo sviluppo di controlli ingegneristici, tecniche sterili e condizionamento pre e post-chirurgico. L’esecuzione appropriata del modello di xenotrapianto si traduce in campioni di innesto di pelle umana di lunga durata per la caratterizzazione sperimentale della pelle umana e test preclinici di composti in vivo.

Introduction

I modelli murini sono spesso usati per fare inferenze sulla biologia umana e sulle malattie, in parte a causa della loro riproducibilità sperimentale e della capacità di manipolazione genetica. Tuttavia, la fisiologia del topo non ricapitola completamente i sistemi di organi umani, in particolare la pelle, e quindi ha limitazioni per l’uso come modello preclinico nello sviluppo di farmaci1. Le differenze anatomiche tra la pelle del topo e quella umana includono differenze negli spessori epiteliali e nell’architettura, mancanza di ghiandole sudoripare eccrine murine e variazioni nel ciclo dei capelli2. Inoltre, sia il braccio innato che quello adattativo del sistema immunitario sono divergenti tra le due specie3. La pelle di topo contiene una popolazione immunitaria unica di cellule T epidermiche dendritiche (DETC), ha una maggiore abbondanza di cellule T γδ dermiche e varia nella localizzazione del sottogruppo di cellule immunitarie rispetto al tessuto umano4. Pertanto, i risultati sperimentali riguardanti la biologia della pelle umana e l’infiammazione beneficiano della convalida con tessuto umano. Mentre i sistemi di coltura in vitro e organoidi sono strumenti ampiamente utilizzati per studiare il tessuto umano, questi sistemi sono limitati dalla ricostituzione immunitaria assente o incompleta e dalla mancanza di connessione con la vascolarizzazione periferica5. Il modello umanizzato di trapianto di pelle di xenotrapianto mira a consentire la manipolazione terapeutica o biologica di percorsi immunitari e non immunitari nei tessuti umani in vivo.

Il modello di xenotrapianto di pelle umana è stato utilizzato per studiare la fisiologia e la farmacologia della pelle, analizzare il rigetto immunitario e le risposte, analizzare i meccanismi del cancro della pelle umana e comprendere le malattie della pelle e la guarigione delle ferite6. Sebbene applicabile a più campi della ricerca sulla pelle, il modello di xenotrapianto ha un rendimento inferiore rispetto agli studi in vitro e manca della facilità di manipolazione genetica impiegata nei modelli murini. I punti temporali all’interno di questo modello possono variare da settimane a mesi e l’innesto di successo richiede strutture e attrezzature adeguate per eseguire questi interventi chirurgici. Tuttavia, il modello di xenotrapianto fornisce un contesto biologico e fisiologico agli esperimenti, mentre i sistemi di coltura organoide, come gli espianti di tessuto, spesso richiedono la replica di una miriade di parti mobili, come i segnali esogeni, a specifici intervalli di tempo7. Pertanto, questo modello è meglio utilizzato per convalidare ulteriormente i risultati osservati in vitro e all’interno di modelli murini, o per lavori che non sono altrimenti biologicamente fattibili. L’uso appropriato del modello di xenotrapianto offre un’opportunità unica per studiare e manipolare il tessuto umano intatto in vivo.

L’ottimizzazione del modello di trapianto di pelle di xenotrapianto si è basata su decenni di ricerca per preservare l’integrità dell’innesto nel tempo. Fondamentale per questo processo è l’utilizzo del topo del recettore della catena gamma (NSG) del diabete non obeso (NOD)-scid, che manca di cellule immunitarie adattative B e T, cellule NK funzionali e ha carenze nei macrofagi e nelle cellule dendritiche8. La natura immunodeficiente di questi ospiti NSG consente il trapianto di cellule ematopoietiche umane, tumori derivati dal paziente e pelle 8,9,10. Nonostante questo ambiente ospite immunosoppressivo, è necessaria un’ulteriore soppressione delle risposte immunitarie neutrofile del topo mediante somministrazione di anti-GR1 per il successo del trapianto10. I principali ostacoli nel trapianto di tessuto intatto sono l’infezione, il rigetto e la difficoltà di ristabilire il flusso sanguigno all’innesto, che a volte porta alla perdita dell’integrità dermica ed epidermica11. Le tecniche che includono la somministrazione di anti-FR1 e l’uso di un’appropriata profondità di innesto migliorano la sopravvivenza del trapianto10. L’ottimizzazione meticolosa consente di eseguire trapianti di pelle di xenotrapianto umano su topi NSG con alti tassi di efficienza e sopravvivenza, compresi tra il 90% e il 100%.

Protocol

Il presente studio è stato approvato ed eseguito in conformità con i protocolli UCSF IACUC (AN191105-01H) e IRB (13-11307). Campioni di pelle, scartati come parte di procedure chirurgiche elettive di routine, come la riparazione dell’ernia, sono stati utilizzati per la presente ricerca. I campioni di pelle sono de-identificati e certificati come Not Human Subjects Research o, se sono richieste informazioni clinicamente identificative per le analisi a valle, i pazienti hanno fornito il consenso scritto ai sensi del prot…

Representative Results

Gli xenotrapianti di pelle umana sono stati eseguiti su topi NSG all’interno di una struttura animale super-barriera. Il successo è stato definito dalla prolungata sopravvivenza del trapianto e del topo e dalla salute comportamentale dei topi post-trapianto. La scarsa sopravvivenza durante la settimana successiva all’intervento chirurgico è stata inizialmente osservata come la più grande barriera al successo sperimentale, con fino al 50% dei topi che richiedono l’eutanasia. Il miglioramento della tecnica sterile e un …

Discussion

Il modello di trapianto di pelle di xenotrapianto di topo è una tecnica chiave per sezionare meccanicamente le risposte immunitarie della pelle umana in un ambiente in vivo 14. Il successo dei trapianti di xenotrapianto cutaneo si basa su un’adeguata preparazione di topi e campioni di pelle e topi e sull’aderenza ai metodi di chirurgia asettica dei roditori15. Il raffreddamento rapido e la corretta conservazione dei campioni di pelle a basse temperature in terreni…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato finanziato in parte da accordi di ricerca sponsorizzati da TRex Bio e sovvenzioni dal NIH (1R01AR075864-01A1). JMM è sostenuto dalla Cancer Research Society (sovvenzione 26005). Riconosciamo il Parnassus Flow Cytometry Core supportato in parte dalle sovvenzioni NIH P30 DK063720, S10 1S10OD021822-01 e S10 1S10OD018040-01.

Materials

10% Neutral Buffered Formalin Fisher SF100-20 Fixative for histology
3M Vetbond Tissue Adhesive 3M 1469SB surgical glue
Alexa 700 CD45 monoclonal antibody (Clone 30F11) Thermo Fischer 56-0451-82 Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Anti-GR1 clone RB6-8C5 BioXcell BE0075 Anti-rejection
APC mouse anti-human CD25  (Clone 2A3) BD Biosciences 340939 Flow cytometry analysis: Surface protein staining
APC-eFluor 780 anti-human HLA-DR (Clone LN3) eBioscience 47-9956-42 Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Autoclave pouches VWR  89140-800 For autoclaving tools and paper towels
Brilliant Violet 60 anti-human CD4 antibody (Clone OKT4 Biolegend 317438 Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Brilliant Violet 65 anti-human CD8a antibody (Clone RPA-T8) Biolegend 301042 Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Brilliant Violet 711 anti-human CD3 antibody (Clone OKT3) Biolegend 317328 Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Buprenex 0.3 mg/mL Covetrus 059122 Analgesia
Carprofen 50 mg/mL Zoetis NADA # 141-199 Analgesia
Collagenase Type IV Worthington 4188 Skin digestion
D42 Dermatome blade Humeca 5.D42BL10 dermatome (1 blade per sample)
Dermatome D42 Humeca 4.D42 dermatome
Disposable Scalpel Bard-Parker 371610 skin preparation
Dissecting T-Pins; 1-1/2 inch, 1000/CS 1.5 Cole-Parmer UX-10915-03 To pin skin specimen for dermatome
Dissection scissors medicon 02.04.10 sample preparation and mouse dissection
DNAse Sigma-Aldrich DN25-1G Skin digestion
eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent eBioscience 00-5521-00 Flow cytometry analysis: Cell Fixation and Permeabilization
eFluor-450 FOXP3 monoclonal antibody (Clone PCH101) eBioscience 48-4776-42 Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining
Electric clippers Kent CL8787-KIT hair removal
Epredia Shandon Instant Eosin Fisher Scientific 6765040 H&E
Epredia Shandon Instant Hematoxylin Fisher Scientific 6765015 H&E
FITC anti-human CD45 (Clone HI30) Tonbo Biosciences 35-0459-T100 Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Forceps  medicon 07.60.07 sample preparation and mouse dissection
Gauze Fisherbrand 22-362-178 Sample preparation
Heating lamp Morganville Scientific HL0100 Post-surgical care
Heating pads 4" x 10" Pristech 20415 Surgical heat supply
Insulin 1cc 12.7 mm syringes BD 329410 drug administration
Isoflurane United States Pharmacopeia (USP)  NDC 66794-013-25 Anesthesia 
Isoflurane machine VetEquip 911103 Anesthesia
Nair for Men Nair ‎ 10022600588556 hair removal
Neomycin and Polymyxin Bisulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic ointment Dechra  NDC 17478-235-35 eye ointment to prevent drying
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice The Jackson Laboratory 005557 Mice
Paper towels Kleenex 100848 May be autoclaved for sterile surfaces
Parafilm Fisher Scientific 13-374-12 Semitransparent sealing film
PE mouse anti-human CD127 (Clone HIL-7R-M21) BD Biosciences 557938 Flow cytometry analysis: Surface protein staining
PE-Cy-7 mouse anti-Ki-67 (Clone B56) BD Biosciences 561283 Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining
PerCP-eFluor-710 CD152 (CTLA-4) monoclonal antibody (Clone 14D3) eBioscience 46-1529-42 Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining
Permeabilization Buffer 10x eBioscience 00-8333-56 Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining buffer
Petri Dish 150 mm Corning 430597 Sample storage
Plastic Wrap Fisherbrand 22-305-654 Site preparation
Providone-Iodine Swab stick PDI S41350 Site sterilization
Soft-Feed and Oral Hydration (Napa Nectar) Se Lab Group Inc NC9066511  For supplementing poorly recovering mice post-surgery
Specimen Collection Cups Fisher Scientific 22-150-266 sample storage
Sterile alcohol prep pad Fisherbrand 22-363-750 skin preparation
Sterile PBS Gibco 14190-144 Media for sample storage
Sterile saline Hospira NDC 0409-4888-02 For drug dilution
Tegaderm Film 4” x 43/4”  3M 1626 transparent film wound dressing
Vaseline Petrolatum Gauze 3” x 8”  Kendall 414600 wound dressing
Violet 510 Ghost Dye  Tonbo Biosciences 13-0870-T100 Flow cytometry analysis: Viability dye

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Cite This Article
Moss, M. I., Pauli, M., Moreau, J. M., Cohen, J. N., Rosenblum, M. D., Lowe, M. M. Xenograft Skin Model to Manipulate Human Immune Responses In Vivo. J. Vis. Exp. (184), e64040, doi:10.3791/64040 (2022).

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