Hier präsentieren wir ein Protokoll mit 2-Photonen-Mikroskopie in München Wistar Fromter Ratten mit Oberflächenglomeruli, um die Auswirkungen einer verlängerten Harnleiterobstruktion auf die glomeruläre Dynamik und Funktion zu quantifizieren.
Die Anwendung neuartiger Mikroskopiemethoden auf geeignete Tierkrankheitsmodelle zur Erforschung der dynamischen Physiologie der Niere bleibt eine Herausforderung. Ratten mit Oberflächenglomeruli bieten eine einzigartige Möglichkeit, physiologische und pathophysiologische Prozesse mittels intravitaler 2-Photonenmikroskopie zu untersuchen. Die Quantifizierung des glomerulären kapillaren Blutflusses und die Vasokonstriktion und -dilatation als Reaktion auf Medikamente, Permeabilität und Entzündung sind nur einige der Prozesse, die untersucht werden können. Darüber hinaus bieten transgene Ratten, d.h. Podozyten, die mit Fluoreszenzfarbstoffen und anderen molekularen Biomarkeransätzen markiert sind, eine erhöhte Auflösung, um Protein-Protein-Interaktionen und die Auswirkungen spezifischer molekularer Veränderungen direkt zu überwachen und zu quantifizieren.
Bei Mäusen, denen nach einem Alter von vier Wochen Oberflächenglomeruli fehlen, wurde die einseitige Harnleiterobstruktion (UUO) für mehrere Wochen verwendet, um Oberflächenglomeruli zu induzieren. Da dieses Induktionsmodell keine Baseline-Studien zulässt, quantifizierten wir die Auswirkungen von UUO auf glomeruläre Prozesse im UUO-Modell in München Wistar Frömter (MWF) Ratten, die unter physiologischen Bedingungen Oberflächenglomeruli aufweisen. Das UUO-Modell für fünf Wochen oder länger induzierte signifikante Veränderungen der groben Nierenmorphologie, der peritubulären und glomerulären Mikrovaskulatur sowie der Struktur und Funktion tubulärer Epithelien. Der Fluss der glomerulären und peritubulären roten Blutkörperchen (RBC) nahm signifikant ab (p < 0,01), wahrscheinlich aufgrund der signifikanten Zunahme der Adhärenz weißer Blutkörperchen (WBCs) in glomerulären und peritubulären Kapillaren. Der glomeruläre Siebkoeffizient von Albumin stieg von 0,015 ± 0,002 in unbehandelten MWFs auf 0,045 ± 0,05 bei 5 Wochen alten UUO-MWF-Ratten. Zwölf Wochen UUO führten zu einem weiteren Anstieg der glomerulären Oberflächendichte und des glomerulären Siebkoeffizienten (GSC) für Albumin. Fluoreszierendes Albumin, das über die Glomeruli gefiltert wurde, wurde von den proximalen Tubuli nicht resorbiert. Diese Daten deuten darauf hin, dass die Verwendung von UUO zur Induktion von Oberflächenglomeruli die Fähigkeit einschränkt, normale glomeruläre Prozesse und Krankheitsveränderungen zu untersuchen und zu interpretieren.
Das Verständnis glomerulärer Prozesse, insbesondere der Podozytenbiologie, ist seit über 50 Jahren ein Ziel. Munich Wistar-Ratten mit Oberflächenglomeruli haben in diesen Studien, einschließlich Mikropunktionsstudien, eine zentrale Rolle gespielt, um zahlreiche Aspekte physiologischer und pathologischer Prozesse zu verstehen 1,2,3. Die Verwendung der Mikroskopie zur intravitalen Untersuchung glomerulärer Komponenten war aufgrund der Auswirkungen der Phototoxizität bis zum Aufkommen der 2-Photonenmikroskopie, die diese toxische Exposition minimierte und die Eindringtiefe erhöhte 1,2, begrenzt. Zusammen mit den rasanten Fortschritten in der Computerhardware und -software hat dies dreidimensionale (3D) und vierdimensionale (Zeit) Studien für Stunden in einer einzigen Einstellung ermöglicht 1,4,5.
Die Quantifizierung des glomerulären kapillaren Blutflusses, Vasokonstriktion und Dilatation als Reaktion auf Medikamente, Permeabilität und die Auswirkungen von Ladung auf Permeabilität und Entzündung sind nur einige der glomerulären Prozesse, die untersucht wurden. Darüber hinaus ist das S1-Segment des proximalen Tubulus identifizierbar, und die Unterschiede im Verhalten von S1- und S2-Röhrenepithel können quantifiziert werden 1,4. Studien an Mäusen, insbesondere mit der universellen Verfügbarkeit transgener Einrichtungen der Maus, haben zu schnellen Fortschritten im Verständnis der Molekularbiologie glomerulärer Krankheitsprozesse geführt. Einzelne Proteine sind in Knockout-Studien für glomeruläre Dysfunktion verantwortlich, insbesondere im Hinblick auf Proteinurie 6,7,8. Die Verwendung von Mausmodellen für glomeruläre Bildgebungsstudien war jedoch begrenzt, da Glomeruli in den zahlreichen untersuchten Stämmen mehr als 100 μm unter der Oberfläche liegen9.
Dies hat die Forscher dazu veranlasst, Mausmodelle zu entwickeln und zu verwenden, was zu Oberflächenglomeruli führt, die untersucht werden können. Das gebräuchlichste Modell ist die Verwendung von vollständigem UUO10,11,12. Am Ende der verlängerten UUO-Periode gibt es zahlreiche Oberflächenglomeruli in Mäusenieren, die untersucht werden können und wurden13,14. Es gab keine Baseline- oder Kontrollstudie in diesen Mausstudien, um die Auswirkungen einer verlängerten UUO auf die glomeruläre Biologie zu bestimmen. Da es sich um ein schweres und anhaltendes Verletzungsmodell handelt, das zu einer schnellen Fibrose und kortikalen Zerstörung führt10,11,12, stellten wir die Hypothese auf, dass es Auswirkungen auf glomeruläre Prozesse und Funktionen geben würde. Um diese Frage zu beantworten, wurden Munich Wistar Fromter (MWF) Ratten mit Oberflächenglomeruli verwendet, um Kontroll-/Baseline-Parameter zu untersuchen, und der Baseline-Befund wurde mit glomerulären Studien an MWF-Ratten nach fünf Wochen UUO verglichen. Wir untersuchten auch Sprague Dawley (SD) Ratten, die nach UUO keine Oberflächenglomeruli haben. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass 5 Wochen UUO bei MWF- und SD-Ratten tatsächlich die Anzahl der Oberflächenglomeruli erhöhen. Dies waren jedoch abnormale Glomeruli mit deutlichen Veränderungen des glomerulären Blutflusses, der Entzündung und der Permeabilität und Größe von Makromolekülen.
Das Studium der glomerulären Physiologie hat viele verschiedene Ansätze gesehen, vor allem die Verwendung von Mikropunktion, Perfusion von isolierten Glomeruli und Mikroskopie. Die Verfügbarkeit von Oberflächenglomeruli in München Wistar-Ratten, Fromter- und Simonsen-Stämmen hat dynamische In-vivo-Studien ermöglicht. Ein wichtiger Hinweis für Forscher, die diese Technologie anwenden, ist die Notwendigkeit, Aufnahmeparameter festzulegen, um konsistente Bilder zwischen den Studien zu erhalten, damit die Autofluoreszenz im Gewebe konsistent bleibt. Die Verwendung eines Dual-Pass-Fluorescein/Rhodamin-Epifluoreszenzwürfels und die Anpassung der Verstärkungseinstellungen an die grünen und roten Emissionskanäle, um auf dem Computerbildschirm nachzuahmen, was durch die Okulare gesehen wird, gewährleistet eine konsistente Farbsignatur in der Autofluoreszenz auch zwischen verschiedenen Mikroskopsystemen.
Der Fromter-Stamm wurde ausgiebig verwendet, da er eine reduzierte Anzahl von Gesamtglomeruli aufweist, ~ 75% normal, und die Männchen entwickeln spontan Bluthochdruck im Alter von etwa 12 Wochen, mit progressiver Proteinurie und anschließender fokaler glomerulärer Sklerose, die schließlich an Nierenversagen sterben12. Die Verwendung dieser Ratten und die Zugabe der 2-Photonenmikroskopie mit ihrer reduzierten Phototoxizität, der verbesserten Eindringtiefe und der Möglichkeit, mehrere fluoreszierende Sonden gleichzeitig zu betrachten, ebneten den Weg für neue Entdeckungen 1,4,5. Mit der Entwicklung von Computerhardware und -software sind quantitative Daten heute der Standard für alle 2-Photonen-Labore. Mehrere quantitative Techniken wurden entwickelt und auf glomeruläre, proximale Tubulus, vaskuläre und interstitielle Prozesse unter physiologischen und Krankheitsbedingungenangewendet 1,4,5,27,28,29,30.
Transgene Mauserzeugungsanlagen fügten dem Studium der Nierenphysiologie und -pathologie eine neue Dimension hinzu, und es war nur eine Frage der Zeit, bis dies mit der 2-Photonenmikroskopie kombiniert wurde, um die Bedeutung spezifischer Genprodukte für die Nierenstruktur und -funktion weiter abzugrenzen. Glomeruli der Maus befinden sich jedoch, außer bei sehr jungen Mäusen, über 100 μm von der Oberfläche der Niereentfernt 9. Die Zwei-Photonen-Mikroskopie wird am besten in einer Tiefe zwischen 20 und 50 μm als Auflösung durchgeführt, und die Fluoreszenzintensität nimmt danach aufgrund der Lichtstreuung des emittierten Lichts und der Absorption durch Wechselwirkung mit Hämoglobin schnell ab. Daher war es notwendig, Oberflächenglomeruli zu induzieren. Der üblicherweise verwendete Ansatz ist ein verlängertes einseitiges Obstruktionsmodell für 12 Wochen. Da diese Modelle keine Baseline-Bestimmungen zulassen, ist eine Trennung der Wirkungen von UUO vom untersuchten Prozess nicht möglich.
Unter Verwendung von MWF-Ratten kann man die glomeruläre Baseline-Funktion mit der folgenden UUO vergleichen. Dieses UUO-Modell ist dafür bekannt, Entzündungen und eine schnelle Fibroserate zu induzieren und wurde verwendet, um CKD und Fibrose zu untersuchen10,11,12. Wie erwartet, gab es sowohl bei den MWF- als auch bei den SD-Ratten eine Zunahme der Oberflächenglomeruli. Darüber hinaus waren die quantitativen Ergebnisse, die nach UUO für die MWF- und SD-Ratten erzielt wurden, sehr vergleichbar. Die hier aufgezeichnete Verringerung des Blutflusses wurde zuvor berichtet, indem mikroskopische Daten nach UUO mit Mikropunktionsdaten verglichen wurden3. Es war auch bekannt, dass die tubuläre und interstitielle Histologie deutlich verändert ist und die PTs meist nicht-funktional sind, wie hier berichtet, mit einem Mangel an Albumin-Endozytose. Die Studien in Abbildung 2 und Abbildung 3 zeigen eine dramatische Verringerung der RBC-Flussrate in glomerulären und peritubulären Kapillaren und eine verbesserte Leukozytenadhäsion. Die Verringerung der Strömung ist wahrscheinlich auf Kapillarblockaden durch Leukozytenadhäsion und Rouleaux-Formationen zurückzuführen.
Um die Entzündung weiter zu bewerten, quantifizierten wir die Albuminpermeabilität und zeigten, dass sie sich verzehnfacht. Darüber hinaus zeigten isolierte Glomeruli, dass die mRNA-Expression für viele Gene zunahm, von denen bisher bekannt war, dass sie bei Nierenentzündungen in einer Vielzahl von Nierenerkrankungszuständen erhöht waren 17,19,20,21,22,23,24,25,26 . Die Zunahme der glomerulären Oberflächendichte und der Albuminpermeabilität war progressiv, wie die 12-Wochen-UUO-Daten zeigen. Die vorliegenden Daten sind die ersten, die direkt zeigen, dass Glomeruli signifikante strukturelle Schäden, Entzündungen und molekulare Veränderungen im UUO-Modell erfahren. Die Ergebnisse stimmen mit einer früheren Studie des gesamten Nierengewebes überein, die Nierenbiopsien von Schafen nach UUO analysierte und mehrere Entzündungsmarker mit erhöhten19 fand. Die vorliegenden Ergebnisse deuten auf eine ausgeprägte Entzündung innerhalb der Glomeruli hin, die bisher nur für kortikales Gewebe bekannt waren.
Die vorliegenden Daten unterscheiden sich von früheren Studien an Mäusen, bei denen keine Veränderungen in der Adhäsionsmolekülexpression, Komplementablagerung und Neutrophileninfiltration zwischen 12-wöchigen posthydronephrotischen und normalen Glomeruli gefunden wurden31. Darüber hinaus verwendete das Hickey-Labor das 12-wöchige UUO-Modell, um Immunreaktionen in Glomeruli von Mäusen zu untersuchen. Sie fanden keine Unterschiede in der Neutrophileninfiltration zwischen vier Wochen alten Glomeruli der Maus und postobstruktiven Glomeruli32,33. Diese späteren Studien wurden durchgeführt, nachdem das Becken der verstopften Niere vom Urin befreit wurde. Wir haben dies nicht getan, da wir die Wirkung von UUO auf die glomeruläre Funktion in vivo bestimmen wollten, ohne die Flüssigkeit, die die Obstruktion verursacht, künstlich zu entfernen. Schließlich wird die Verwendung von UUO bei Mäusen durch die Bildgebung von Glomeruli bei mehr als 100 μm unter der Oberfläche ersetzt. Obwohl möglich, gibt es einen Kompromiss zwischen Auflösung und Intensität, die beide signifikant reduziert werden, wenn man über 50 μm34 hinausgeht.
Die vorgestellten Ergebnisse sind nicht überraschend, wenn man die Daten aus der vorhandenen Literatur zu histologischen Veränderungen, Bildung von atubulären Glomeruli, Entzündungen, Fibrose, Hämodynamik zusammenfügt10,11,12. Die vorgestellten Daten, einschließlich Leukozytenadhäsion, Rouleaux-Formationen, glomerulären molekularen Entzündungsmarkern und erhöhter Albuminpermeabilität, deuten weiter auf die ausgedehnte Entzündung hin, die in diesem UUO-Modell auch nach fünf Wochen andauert und auch nach zwölf Wochen vorhanden ist. Es ist klar, dass chronische UUO kein physiologischer Zustand ist, und die Verwendung von UUO zur Induktion von Oberflächenglomeruli stellt ein Verletzungsmodell dar. Die MWF-Ratten, die unter physiologischen Bedingungen oberflächliche Glomeruli aufweisen, können longitudinal untersucht werden, wenn eine Verletzung auftritt. Es ist möglich, transgene Ratten zu erzeugen, und zahlreiche Forscher erzeugen sie mit Biosensoren, um spezifische Fragen zu stellen. Insbesondere das Medical College of Wisconsin hat jetzt eine Kolonie von MWF-Ratten und hat transgene Ratten hergestellt, um glomeruläre Prozesse unter physiologischen und pathologischen Bedingungen zu untersuchen. Diese MWF-Ratten bieten eine großartige Gelegenheit, glomeruläre Prozesse bei normalen, kranken und genetisch veränderten Ratten zu untersuchen.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde vom National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases Grants RO1DK091623 und P30DK079312 (an B.A.M.) unterstützt. Wir danken den Mitarbeitern der Genomics Core Facility der Research Technology Support Facility (RTSF) der Michigan State University für die Durchführung der Nanostring-Analyse.
70 µm sterile cell strainer | Corning | #421751 | |
100 µm sterile cell strainer | Corning | #421752 | |
CA Micro scissors Model 1C300 | Electron Microscopy Sciences | Cat# 72930 | |
Electric heating pad | Sunbeam | Kroger | |
Handling Forceps | Electron Microscopy Sciences | Cat# 72962 | |
Kelly Hemostatic Forceps (straight) | Electron Microscopy Sciences | Cat#72930 | |
Leica Dive SP-8 Multi-Photon Inverted Microscope | Leica Microsystems | Note: Version 7.1r1 | |
MaiTai DeepSee titanium-sapphire laser | Spectra-Physics | NA | |
Mayo Dissecting Scissors | Electron Microscopy Sciences | Cat# 78180-1C3 | |
Metamorph Image processing Software | Molecular Dynamics | Cat# 78266-04 | |
Microsoft Excel | Microsoft Corportation | 2007 version | |
Quant-iT RNA Assay Kit | Invitrogen/ThermoFisher | Q33140 | |
Reptitherm Undertank Heater | Zoomed | Amazon | |
RNeasy MinElute Cleanup Kit (Spin columns) | Qiagen | 74204 | |
RPE buffer | Qiagen | 1018013 | |
Strate-Line Autoclave Tape | Fisher Scientific | Cat# 11-889-1 | |
TRI Reagent | Sigma | T9424 | |
Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip) | Electron Microscopy Sciences | Cat# 70665-07 |