ここでは、表面糸球体を有するミュンヘンWistar Fromterラットにおける2光子顕微鏡を使用して、糸球体の動態と機能に対する長期の尿管閉塞の影響を定量化するプロトコルを紹介します。
腎臓の動的生理機能を探索するために、適切な動物疾患モデルに新しい顕微鏡法を適用することは依然として課題です。表面糸球体を有するラットは、生体内2光子顕微鏡を使用して生理学的および病態生理学的プロセスを調査するユニークな機会を提供します。糸球体毛細血管血流の定量化、および薬物、透過性、および炎症に応答した血管収縮および拡張は、研究できるプロセスのほんの一部です。さらに、トランスジェニックラット、すなわち蛍光色素および他の分子バイオマーカーアプローチで標識された足細胞は、タンパク質間相互作用および特定の分子変化の影響を直接監視および定量するためのより高い分解能を提供する。
生後4週間後に表面糸球体が欠損するマウスでは、数週間の片側尿管閉塞(UUO)を使用して表面糸球体を誘導しています。この誘導モデルではベースライン研究ができないため、生理学的条件下で表面糸球体を有するミュンヘンヴィスターフレムター(MWF)ラットのUUOモデルで糸球体プロセスに対するUUOの効果を定量化しました。5週間以上のUUOモデルは、総腎形態、尿細管周囲および糸球体微小血管系、ならびに尿細管上皮の構造および機能に有意な変化を誘発した。糸球体および尿細管周囲赤血球(RBC)の流れは、おそらく糸球体および尿細管周囲毛細血管内の白血球(WBC)の付着の有意な増加により、有意に減少しました(p < 0.01)。アルブミンの糸球体ふるい係数は、未処理のMWFの0.015±0.002から5週齢のUUO MWFラットの0.045±0.05に増加しました。UUOを12週間投与すると、アルブミンの表面糸球体密度と糸球体ふるい係数(GSC)がさらに増加しました。糸球体全体でろ過された蛍光アルブミンは、近位尿細管に再吸収されませんでした。これらのデータは、UUOを使用して表面糸球体を誘導すると、正常な糸球体プロセスと疾患の変化を研究および解釈する能力が制限されることを示唆しています。
糸球体プロセス、特に足細胞生物学を理解することは、50年以上の目標でした。表面糸球体を有するミュンヘンWistarラットは、生理学的および病理学的プロセスの多くの側面を理解するために、マイクロパンクチャー研究を含むこれらの研究において中心的な役割を果たしてきました1,2,3。糸球体成分を生体内に研究するための顕微鏡法の利用は、この毒性曝露を最小限に抑え、浸透深さを増加させる2光子顕微鏡法の出現まで、光毒性の影響のために制限されていました1,2。コンピュータのハードウェアとソフトウェアの急速な進歩に加えて、これにより、単一の設定で何時間もの3次元(3D)および4次元(時間)の研究が可能になりました1,4,5。
糸球体毛細血管血流の定量化、薬物に応答した血管収縮および拡張、透過性、ならびに透過性および炎症に対する電荷の影響は、研究されてきた糸球体プロセスのほんの一部です。さらに、近位尿細管のS1セグメントが識別可能であり、S1およびS2尿細管上皮の挙動の違いを定量化することができる1,4。マウスでの研究は、特にマウストランスジェニック施設の普遍的な利用可能性により、糸球体疾患プロセスの分子生物学の理解に急速な進歩をもたらしました。個々のタンパク質は、特にタンパク尿に関して、ノックアウト研究における糸球体機能障害の原因です6,7,8。しかし、糸球体イメージング研究のためのマウスモデルの利用は、研究された多数の系統において糸球体が表面から100μm以上下にあるため、制限されていました9。
これにより、研究者はマウスモデルを開発および利用し、研究可能な表面糸球体をもたらしました。最も一般的なモデルは、完全なUUO10,11,12の使用です。延長されたUUO期間の終わりに、マウス腎臓には多数の表面糸球体が存在し、研究することができ、研究されている13,14。これらのマウス研究では、糸球体生物学に対する長期UUOの影響を決定するためのベースラインまたは対照研究はありませんでした。.これは急速な線維症と皮質破壊をもたらす重度で長期にわたる損傷モデルであるため10,11,12、糸球体のプロセスと機能に影響を与えると仮定しました。この質問に答えるために、表面糸球体を有するミュンヘンウィスターフロムター(MWF)ラットを使用して対照/ベースラインパラメータを研究し、ベースライン所見を5週間のUUO後のMWFラットの糸球体研究と比較しました。また、UUO後に表面糸球体を持たないSprague Dawley(SD)ラットについても研究しました。この知見は、MWFラットとSDラットのUUOを5週間投与すると、実際に表面糸球体の数が増加することを示している。しかし、これらは糸球体の血流、炎症、および高分子の透過性とサイズに著しい変化を伴う異常な糸球体でした。
糸球体生理学の研究は、多くの異なるアプローチ、特にマイクロパンクチャーの使用、孤立した糸球体の灌流、および顕微鏡検査を見てきました。ミュンヘンWistarラット、FromterおよびSimonsen株における表面糸球体の利用可能性は、 in vivo 動的研究を可能にした。この技術を採用する研究者にとって重要な注意点の1つは、組織内の自己蛍光が一貫しているように、研究間で一貫した画像を維持するために取得パラメータを設定する必要があることです。デュアルパスフルオレセイン/ローダミン落射蛍光キューブを利用し、ゲイン設定を緑と赤の発光チャンネルに調整して、接眼レンズを通して見られるものをコンピューター画面上で模倣することで、異なる顕微鏡システム間でも自家蛍光で一貫したカラーシグネチャが保証されます。
Fromter株は、総糸球体数が減少し、~75%正常であり、男性は12週齢頃に高血圧を自発的に発症し、進行性のタンパク尿とそれに続く限局性糸球体硬化症を伴い、最終的には腎不全で死亡するため、広く使用されています12。これらのラットの使用と、光毒性の低減、浸透深度の改善、および複数の蛍光プローブを同時に観察できる2光子顕微鏡の追加により、新しい発見への道が開かれました1,4,5。コンピュータのハードウェアとソフトウェアの開発により、定量データは現在、すべての2光子実験室の標準となっています。複数の定量的手法が開発され、生理学的および疾患条件下での糸球体、近位尿細管、血管、および間質プロセスに適用されています1、4、5、27、28、29、30。
トランスジェニックマウス生成施設は、腎臓の生理学と病理学の研究に新しい次元を追加し、これが2光子顕微鏡と組み合わされて、腎臓の構造と機能における特定の遺伝子産物の重要性をさらに明らかにするのは時間の問題でした。しかし、マウス糸球体は、非常に若いマウスを除いて、腎臓の表面から100μm以上に位置しています9。二光子顕微鏡は、分解能として20〜50μmの深さで行うのが最適であり、その後、放出された光の光散乱とヘモグロビンとの相互作用からの吸収により、蛍光強度が急速に減少します。そのため、表面糸球体を誘導する必要があった。一般的に使用されるアプローチは、12週間の長期の片側閉塞モデルです。これらのモデルではベースラインの決定ができないため、UUOの効果を調査中のプロセスから分離することはできません。
MWFラットを使用して、ベースライン糸球体機能を次のUUOと比較することができます。このUUOモデルは、炎症と急速な線維症を誘発することが知られており、CKDと線維症の研究に使用されています10、11、12。予想通り、MWFラットとSDラットの両方で表面糸球体が増加しました。さらに、MWFラットとSDラットについてUUO後に得られた定量結果は非常に同等でした。ここで記録された血流の減少は、UUO後の顕微鏡データと微小穿刺データ3を比較して以前に報告されていました。また、尿細管組織像と間質組織像が著しく変化し、PTはほとんど機能せず、ここで報告されているように、アルブミンエンドサイトーシスが不足していることもよく知られていました。図2および図3の研究は、糸球体および尿細管周囲毛細血管における赤血球体流量の劇的な減少とWBC接着の増強を示しています。流量の減少は、WBC接着およびルーロー形成による毛細管閉塞による可能性が高い。
炎症をさらに評価するために、アルブミン透過性を定量化し、10倍に増加することを示しました。さらに、単離された糸球体は、さまざまな腎臓病状態における腎臓炎症で増加することが以前に知られている多くの遺伝子のmRNA発現が増加したことを示しました17、19、20、21、22、23、24、25、26.糸球体表面密度とアルブミン透過性の増加は、12週間のUUOデータによって示されるように、進行性であった。本データは、糸球体がUUOモデルにおいて著しい構造的損傷、炎症、および分子変化を受けることを直接示した最初のデータである。結果は、UUO後の羊腎臓生検を分析した腎臓組織全体の以前の研究と一致しており、複数の炎症マーカーが上昇していることを発見しました19。本結果は、以前は皮質組織についてのみ知られていた糸球体内に顕著な炎症が存在することを示している。
現在のデータは、12週間後のヒドロネフローゼと正常な糸球体の間で接着分子発現、補体沈着、および好中球浸潤に変化が見られなかったマウスでの以前の研究とは異なります31。さらに、ヒッキー研究所は、マウスの糸球体における免疫反応を研究するために12週間のUUOモデルを使用しました。彼らは、4週齢のマウス糸球体と閉塞後糸球体の間で好中球の浸潤に違いは見られませんでした32,33。これらの後の研究は、閉塞した腎臓の骨盤から尿が排出された後に実施されました。閉塞の原因となる体液を人工的に除去することなく、生体内の糸球体機能に対するUUOの効果を決定したかったため、これを行いませんでした。最後に、マウスでのUUOの使用は、表面下100μmを超える糸球体のイメージングに置き換えられています。可能ですが、分解能と強度のトレードオフがあり、50 μm34を超えるとどちらも大幅に低下します。
提示された結果は、組織学的変化、管状糸球体の形成、炎症、線維症、血行動態に関する既存の文献からのデータを1つまとめても驚くべきことではありません10,11,12。WBC接着、ルーロー形成、糸球体分子炎症マーカー、アルブミン透過性の増加など、提示されたデータは、このUUOモデルで5週間でも進行中であり、12週間でも存在する広範な炎症をさらに示しています。明らかに、慢性UUOは生理学的状態ではなく、表面糸球体を誘導するためのUUOの使用は傷害モデルを表しています。生理学的条件下で表面糸球体を有するMWFラットは、損傷が発生するにつれて縦断的に研究することができる。トランスジェニックラットを生成することは可能であり、多くの研究者が特定の質問をするためにバイオセンサーを使用してそれらを作成しています。特に、ウィスコンシン医科大学は現在、MWFラットのコロニーを持っており、生理学的および病理学的条件下で糸球体プロセスを研究する目的でトランスジェニックラットを製造しています。これらのMWFラットは、正常、罹患、および遺伝子組み換えラットの糸球体プロセスを研究する絶好の機会を提供します。
The authors have nothing to disclose.
この研究は、国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所助成金RO1DK091623およびP30DK079312(BAMへ)の支援を受けました。ナノストリング分析を実施してくれたミシガン州立大学の研究技術支援施設(RTSF)のゲノミクスコアファシリティのスタッフに感謝します。
70 µm sterile cell strainer | Corning | #421751 | |
100 µm sterile cell strainer | Corning | #421752 | |
CA Micro scissors Model 1C300 | Electron Microscopy Sciences | Cat# 72930 | |
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Metamorph Image processing Software | Molecular Dynamics | Cat# 78266-04 | |
Microsoft Excel | Microsoft Corportation | 2007 version | |
Quant-iT RNA Assay Kit | Invitrogen/ThermoFisher | Q33140 | |
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RNeasy MinElute Cleanup Kit (Spin columns) | Qiagen | 74204 | |
RPE buffer | Qiagen | 1018013 | |
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TRI Reagent | Sigma | T9424 | |
Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip) | Electron Microscopy Sciences | Cat# 70665-07 |