Aquí, presentamos un protocolo utilizando microscopía de 2 fotones en ratas Munich Wistar Fromter con glomérulos de superficie para cuantificar los efectos de la obstrucción ureteral prolongada en la dinámica y función glomerular.
La aplicación de nuevos métodos de microscopía a modelos adecuados de enfermedades animales para explorar la fisiología dinámica del riñón sigue siendo un desafío. Las ratas con glomérulos superficiales brindan una oportunidad única para investigar procesos fisiológicos y fisiopatológicos utilizando microscopía intravital de 2 fotones. La cuantificación del flujo sanguíneo capilar glomerular y la vasoconstricción y dilatación en respuesta a fármacos, permeabilidad e inflamación son solo algunos de los procesos que se pueden estudiar. Además, las ratas transgénicas, es decir, los podocitos marcados con colorantes fluorescentes y otros enfoques de biomarcadores moleculares, proporcionan una mayor resolución para monitorear y cuantificar directamente las interacciones proteína-proteína y los efectos de alteraciones moleculares específicas.
En ratones, que carecen de glomérulos superficiales después de las cuatro semanas de edad, se ha utilizado la obstrucción ureteral unilateral (UUO) durante varias semanas para inducir glomérulos superficiales. Como este modelo de inducción no permite estudios basales, cuantificamos los efectos de la UUO en los procesos glomerulares en el modelo UUO en ratas Wistar Frömter (MWF) de Múnich, que tienen glomérulos superficiales en condiciones fisiológicas. El modelo UUO durante cinco semanas o más indujo alteraciones significativas en la morfología renal macroscópica, la microvasculatura peritubular y glomerular, así como la estructura y función de los epitelios tubulares. El flujo glomerular y peritubular de glóbulos rojos (RBC) disminuyó significativamente (p < 0,01), probablemente debido al aumento significativo en la adhesión de glóbulos blancos (WBC) dentro de los capilares glomerulares y peritubulares. El coeficiente de tamizado glomerular de la albúmina aumentó de 0,015 ± 0,002 en MWF no tratados a 0,045 ± 0,05 en ratas UUO MWF de 5 semanas de edad. Doce semanas de UUO dieron lugar a aumentos adicionales en la densidad glomerular de superficie y el coeficiente de tamizado glomerular (GSC) para la albúmina. La albúmina fluorescente filtrada a través de los glomérulos no fue reabsorbida por los túbulos proximales. Estos datos sugieren que el uso de UUO para inducir glomérulos superficiales limita la capacidad de estudiar e interpretar los procesos glomerulares normales y las alteraciones de la enfermedad.
Comprender los procesos glomerulares, especialmente la biología de los podocitos, ha sido un objetivo durante más de 50 años. Las ratas Wistar de Munich con glomérulos superficiales han desempeñado un papel central en estos estudios, incluidos los estudios de micropunción, para comprender numerosos aspectos de los procesos fisiológicos y patológicos 1,2,3. La utilización de microscopía para estudiar los componentes glomerulares por vía intravital fue limitada debido a los efectos de la fototoxicidad hasta el advenimiento de la microscopía de 2 fotones que minimizó esta exposición tóxica y aumentó la profundidad de penetración 1,2. Junto con los rápidos avances en hardware y software de computadora, esto ha permitido estudios tridimensionales (3D) y cuatridimensionales (tiempo) durante horas en un solo entorno 1,4,5.
La cuantificación del flujo sanguíneo capilar glomerular, la vasoconstricción y la dilatación en respuesta a los fármacos, la permeabilidad y los efectos de la carga sobre la permeabilidad y la inflamación son solo algunos de los procesos glomerulares que se han estudiado. Además, el segmento S1 del túbulo proximal es identificable, y las diferencias en el comportamiento del epitelio tubular S1 y S2 pueden cuantificarse 1,4. Los estudios en ratones, especialmente con la disponibilidad universal de instalaciones transgénicas de ratón, han llevado a rápidos avances en la comprensión de la biología molecular de los procesos de enfermedad glomerular. Las proteínas individuales son responsables de la disfunción glomerular en estudios knockout, especialmente con respecto a la proteinuria 6,7,8. Sin embargo, la utilización de modelos de ratón para estudios de imagen glomerular ha sido limitada ya que los glomérulos están a más de 100 μm por debajo de la superficie en las numerosas cepas estudiadas9.
Esto ha llevado a los investigadores a desarrollar y utilizar modelos de ratón que resultan en glomérulos superficiales que pueden ser estudiados. El modelo más común es el uso de UUO completo10,11,12. Al final del período prolongado de UUO, hay numerosos glomérulos superficiales en riñones de ratones que pueden ser y han sido estudiados13,14. No ha habido ningún estudio basal o de control en estos estudios con ratones para determinar los efectos de la UUO prolongada en la biología glomerular. Como este es un modelo severo y prolongado de lesión que resulta en fibrosis rápida y destrucción cortical10,11,12, planteamos la hipótesis de que habría efectos sobre los procesos glomerulares y la función. Para responder a esta pregunta, se utilizaron ratas Munich Wistar Fromter (MWF) con glomérulos de superficie para estudiar los parámetros de control / basales, y el hallazgo basal se comparó con estudios glomerulares en ratas MWF después de cinco semanas de UUO. También estudiamos ratas Sprague Dawley (SD) que no tienen glomérulos superficiales después de UUO. Los hallazgos indican que 5 semanas de UUO en ratas MWF y SD aumentan el número de glomérulos superficiales. Sin embargo, estos fueron glomérulos anormales con cambios marcados en el flujo sanguíneo glomerular, inflamación y permeabilidad y tamaño de las macromoléculas.
El estudio de la fisiología glomerular ha visto muchos enfoques diferentes, especialmente el uso de micropunción, perfusión de glomérulos aislados y microscopía. La disponibilidad de glomérulos superficiales en ratas Wistar de Múnich, cepas Fromter y Simonsen, ha permitido estudios dinámicos in vivo . Una nota importante para los investigadores que adoptan esta tecnología es la necesidad de establecer parámetros de adquisición para mantener imágenes consistentes entre los estudios, de modo que la autofluorescencia en el tejido permanezca constante. Utilizar un cubo de epifluorescencia de fluoresceína/rodamina de doble paso y ajustar la configuración de ganancia a los canales de emisión verde y rojo para imitar en la pantalla de la computadora lo que se ve a través de los oculares asegurará una firma de color consistente en la autofluorescencia incluso entre diferentes sistemas de microscopio.
La cepa de Fromter ha sido ampliamente utilizada ya que tiene un número reducido de glomérulos totales, ~75% normal, y los varones desarrollan espontáneamente hipertensión alrededor de las 12 semanas de edad, con proteinuria progresiva y posterior esclerosis glomerular focal, muriendo finalmente de insuficiencia renal12. El uso de estas ratas y la adición de microscopía de 2 fotones con su fototoxicidad reducida, profundidad de penetración mejorada y la capacidad de ver múltiples sondas fluorescentes simultáneamente allanaron el camino para nuevos descubrimientos 1,4,5. Con el desarrollo de hardware y software informático, los datos cuantitativos son ahora el estándar para todos los laboratorios de 2 fotones. Se han desarrollado múltiples técnicas cuantitativas y aplicadas a procesos glomerulares, tubulales proximales, vasculares e intersticiales en condiciones fisiológicas y de enfermedad 1,4,5,27,28,29,30.
Las instalaciones generadoras de ratones transgénicos agregaron una nueva dimensión al estudio de la fisiología y patología renal, y era solo cuestión de tiempo hasta que esto se combinara con microscopía de 2 fotones para delinear aún más la importancia de productos genéticos específicos en la estructura y función renal. Sin embargo, los glomérulos de ratón, excepto en ratones muy jóvenes, se encuentran a más de 100 μm de la superficie del riñón9. La microscopía de dos fotones se realiza mejor a una profundidad de entre 20 y 50 μm como resolución, y la intensidad de fluorescencia disminuye rápidamente a partir de entonces debido a la dispersión de la luz emitida y la absorción de la interacción con la hemoglobina. Por lo tanto, fue necesario inducir glomérulos superficiales. El enfoque comúnmente utilizado es un modelo de obstrucción unilateral prolongada durante 12 semanas. Como estos modelos no permiten determinaciones de línea de base, no es posible separar los efectos de la UUO del proceso que se está estudiando.
Usando ratas MWF, se puede comparar la función glomerular basal con la siguiente UUO. Se sabe que este modelo UUO induce inflamación y una tasa rápida de fibrosis y se ha utilizado para estudiar la ERC y la fibrosis10,11,12. Como se esperaba, hubo un aumento en los glomérulos superficiales tanto en las ratas MWF como en SD. Además, los resultados cuantitativos obtenidos después de UUO para las ratas MWF y SD fueron muy comparables. La reducción en el flujo sanguíneo registrada aquí había sido reportada previamente comparando datos microscópicos después de UUO con datos de micropunción3. También era bien sabido que la histología tubular e intersticial está marcadamente alterada, y los TP son en su mayoría no funcionales, como se informa aquí, con una falta de endocitosis de albúmina. Los estudios en la Figura 2 y la Figura 3 muestran una reducción dramática en la tasa de flujo de glóbulos rojos en capilares glomerulares y peritubulares y una mayor adhesión de leucocitos. Las reducciones en el flujo probablemente se deban al bloqueo capilar de la adhesión de leucocitos y las formaciones de rouleaux.
Para evaluar aún más la inflamación, cuantificamos la permeabilidad a la albúmina y mostramos que aumenta diez veces. Además, los glomérulos aislados mostraron que la expresión del ARNm aumentó para muchos genes previamente conocidos por aumentar la inflamación renal en una variedad de estados de enfermedad renal 17,19,20,21,22,23,24,25,26 . Los aumentos en la densidad superficial glomerular y la permeabilidad a la albúmina fueron progresivos, como lo muestran los datos de UUO de 12 semanas. Los datos actuales son los primeros en mostrar directamente que los glomérulos sufren daños estructurales significativos, inflamación y cambios moleculares en el modelo UUO. Los resultados son consistentes con un estudio anterior de tejido renal completo que analizó biopsias de riñón de ovejas después de UUO, encontrando múltiples marcadores de inflamación elevados19. Los resultados actuales indican que existe una marcada inflamación dentro de los glomérulos, previamente conocida solo para el tejido cortical.
Los datos actuales difieren de estudios anteriores en ratones donde no se encontraron cambios en la expresión de la molécula de adhesión, la deposición del complemento y la infiltración de neutrófilos entre los glomérulos posthidronefróticos y normales de 12 semanas31. Además, el laboratorio de Hickey utilizó el modelo UUO de 12 semanas para estudiar las reacciones inmunes en glomérulos de ratones. No encontraron diferencias en la infiltración de neutrófilos entre los glomérulos de ratón de cuatro semanas de edad y los glomérulos postobstructivos32,33. Estos estudios posteriores se realizaron después de que la pelvis del riñón obstruido se drenó de orina. No hicimos esto porque queríamos determinar el efecto de UUO sobre la función glomerular como sería in vivo, sin eliminar artificialmente el líquido que causa la obstrucción. Finalmente, el uso de UUO en ratones está siendo reemplazado por glomérulos de imágenes a más de 100 μm debajo de la superficie. Si bien es posible, hay una compensación de resolución e intensidad, ambas se reducen significativamente a medida que uno va más allá de 50 μm34.
Los resultados presentados no son sorprendentes si se juntan los datos de la literatura existente sobre cambios histológicos, formación de glomérulos atubulares, inflamación, fibrosis, hemodinámica10,11,12. Los datos presentados, incluida la adhesión de leucocitos, las formaciones de rouleaux, los marcadores de inflamación molecular glomerular y el aumento de la permeabilidad a la albúmina, indican además la extensa inflamación que está en curso en este modelo UUO incluso a las cinco semanas y también presente a las doce semanas. Claramente, la UUO crónica no es un estado fisiológico, y el uso de UUO para inducir glomérulos superficiales representa un modelo de lesión. Las ratas MWF, que tienen glomérulos superficiales en condiciones fisiológicas, pueden estudiarse longitudinalmente a medida que se produce una lesión. Es posible generar ratas transgénicas, y numerosos investigadores las están creando con biosensores para hacer preguntas específicas. En particular, el Colegio Médico de Wisconsin ahora tiene una colonia de ratas MWF y ha hecho ratas transgénicas con el propósito de estudiar procesos glomerulares en condiciones fisiológicas y patológicas. Estas ratas MWF ofrecen una gran oportunidad para estudiar procesos glomerulares en ratas normales, enfermas y genéticamente alteradas.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales Subvenciones RO1DK091623 y P30DK079312 (a B.A.M.). Agradecemos al personal de la Instalación Central de Genómica de la Instalación de Apoyo a la Tecnología de Investigación (RTSF) de la Universidad Estatal de Michigan por realizar el análisis de Nanostring.
70 µm sterile cell strainer | Corning | #421751 | |
100 µm sterile cell strainer | Corning | #421752 | |
CA Micro scissors Model 1C300 | Electron Microscopy Sciences | Cat# 72930 | |
Electric heating pad | Sunbeam | Kroger | |
Handling Forceps | Electron Microscopy Sciences | Cat# 72962 | |
Kelly Hemostatic Forceps (straight) | Electron Microscopy Sciences | Cat#72930 | |
Leica Dive SP-8 Multi-Photon Inverted Microscope | Leica Microsystems | Note: Version 7.1r1 | |
MaiTai DeepSee titanium-sapphire laser | Spectra-Physics | NA | |
Mayo Dissecting Scissors | Electron Microscopy Sciences | Cat# 78180-1C3 | |
Metamorph Image processing Software | Molecular Dynamics | Cat# 78266-04 | |
Microsoft Excel | Microsoft Corportation | 2007 version | |
Quant-iT RNA Assay Kit | Invitrogen/ThermoFisher | Q33140 | |
Reptitherm Undertank Heater | Zoomed | Amazon | |
RNeasy MinElute Cleanup Kit (Spin columns) | Qiagen | 74204 | |
RPE buffer | Qiagen | 1018013 | |
Strate-Line Autoclave Tape | Fisher Scientific | Cat# 11-889-1 | |
TRI Reagent | Sigma | T9424 | |
Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip) | Electron Microscopy Sciences | Cat# 70665-07 |