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Medicine

Utilizzo della microscopia a 2 fotoni per quantificare gli effetti dell'ostruzione ureterale unilaterale cronica sui processi glomerulari

Published: March 04, 2022
doi:
10.3791/63329
, , ,
1Department of Medicine, Division of Nephrology,Indiana University School of Medicine

Summary

Qui presentiamo un protocollo che utilizza la microscopia a 2 fotoni a Monaco di Baviera nei ratti Wistar Fromter con glomeruli di superficie per quantificare gli effetti dell’ostruzione ureterale prolungata sulla dinamica e sulla funzione glomerulare.

Abstract

L’applicazione di nuovi metodi di microscopia a modelli di malattie animali adatti per esplorare la fisiologia dinamica del rene rimane una sfida. I ratti con glomeruli superficiali offrono un’opportunità unica per studiare i processi fisiologici e fisiopatologici utilizzando la microscopia intravitale a 2 fotoni. La quantificazione del flusso sanguigno capillare glomerulare e la vasocostrizione e dilatazione in risposta ai farmaci, la permeabilità e l’infiammazione sono solo alcuni dei processi che possono essere studiati. Inoltre, ratti transgenici, cioè podociti marcati con coloranti fluorescenti e altri approcci di biomarcatori molecolari, forniscono una maggiore risoluzione per monitorare e quantificare direttamente le interazioni proteina-proteina e gli effetti di specifiche alterazioni molecolari.

Nei topi, che mancano di glomeruli superficiali dopo quattro settimane di età, l’ostruzione ureterale unilaterale (UUO) per diverse settimane è stata utilizzata per indurre glomeruli superficiali. Poiché questo modello di induzione non consente studi di base, abbiamo quantificato gli effetti dell’UUO sui processi glomerulari nel modello UUO nei ratti Wistar Frömter (MWF) di Monaco, che hanno glomeruli superficiali in condizioni fisiologiche. Il modello UUO per cinque settimane o più ha indotto alterazioni significative della morfologia renale grossolana, della microvascolarizzazione peritubulare e glomerulare, nonché della struttura e della funzione degli epiteli tubulari. Il flusso glomerulare e peritubulare dei globuli rossi (RBC) è diminuito significativamente (p < 0,01), probabilmente a causa del significativo aumento dell'aderenza dei globuli bianchi (WBC) all'interno dei capillari glomerulari e peritubulari. Il coefficiente di setacciatura glomerulare dell'albumina è aumentato da 0,015 ± 0,002 nei MWF non trattati a 0,045 ± 0,05 nei ratti MWF UUO di 5 settimane. Dodici settimane di UUO hanno portato a ulteriori aumenti della densità glomerulare superficiale e del coefficiente di setacciatura glomerulare (GSC) per l'albumina. L'albumina fluorescente filtrata attraverso i glomeruli non è stata riassorbita dai tubuli prossimali. Questi dati suggeriscono che l'uso di UUO per indurre glomeruli superficiali limita la capacità di studiare e interpretare i normali processi glomerulari e le alterazioni della malattia.

Introduction

Comprendere i processi glomerulari, in particolare la biologia dei podociti, è stato un obiettivo per oltre 50 anni. I ratti Wistar di Monaco con glomeruli superficiali hanno svolto un ruolo centrale in questi studi, compresi gli studi di micropuntura, per comprendere numerosi aspetti dei processi fisiologici e patologici 1,2,3. L’uso della microscopia per studiare i componenti glomerulari per via intravitale è stato limitato a causa degli effetti della fototossicità fino all’avvento della microscopia a 2 fotoni che ha minimizzato questa esposizione tossica e aumentato la profondità di penetrazione 1,2. Insieme ai rapidi progressi nell’hardware e nel software del computer, questo ha permesso studi tridimensionali (3D) e quadridimensionali (tempo) per ore in un unico ambiente 1,4,5.

La quantificazione del flusso sanguigno capillare glomerulare, la vasocostrizione e la dilatazione in risposta ai farmaci, la permeabilità e gli effetti della carica sulla permeabilità e l’infiammazione sono solo alcuni dei processi glomerulari che sono stati studiati. Inoltre, il segmento S1 del tubulo prossimale è identificabile e le differenze nel comportamento dell’epitelio tubulare S1 e S2 possono essere quantificate 1,4. Gli studi sui topi, in particolare con la disponibilità universale di strutture transgeniche di topo, hanno portato a rapidi progressi nella comprensione della biologia molecolare dei processi di malattia glomerulare. Le singole proteine sono responsabili della disfunzione glomerulare negli studi knockout, specialmente per quanto riguarda la proteinuria 6,7,8. Tuttavia, l’utilizzo di modelli murini per gli studi di imaging glomerulare è stato limitato in quanto i glomeruli si trovano più di 100 μm sotto la superficie nei numerosi ceppi studiati9.

Ciò ha portato i ricercatori a sviluppare e utilizzare modelli murini con conseguente glomeruli superficiali che possono essere studiati. Il modello più comune è l’uso di UUO completo10,11,12. Alla fine del periodo prolungato di UUO, ci sono numerosi glomeruli superficiali nei reni dei topi che possono essere e sono stati studiati13,14. Non c’è stato alcuno studio di riferimento o di controllo in questi studi sui topi per determinare gli effetti di UUO prolungato sulla biologia glomerulare. Poiché si tratta di un modello grave e prolungato di lesione con conseguente fibrosi rapida e distruzione corticale10,11,12, abbiamo ipotizzato che ci sarebbero effetti sui processi glomerulari e sulla funzione. Per rispondere a questa domanda, i ratti Munich Wistar Fromter (MWF) con glomeruli superficiali sono stati utilizzati per studiare i parametri di controllo / basali e il risultato basale è stato confrontato con studi glomerulari in ratti MWF dopo cinque settimane di UUO. Abbiamo anche studiato ratti Sprague Dawley (SD) che non hanno glomeruli superficiali dopo UUO. I risultati indicano che 5 settimane di UUO nei ratti MWF e SD aumentano effettivamente il numero di glomeruli superficiali. Tuttavia, questi erano glomeruli anormali con marcati cambiamenti nel flusso sanguigno glomerulare, infiammazione e permeabilità e dimensione delle macromolecole.

Protocol

Tutti gli esperimenti hanno seguito la Guida per la cura e l’uso degli animali da laboratorio e sono stati approvati dal Comitato per la cura e l’uso degli animali presso la Scuola di Medicina dell’Università dell’Indiana. 1. Preparazione del Munich Wistar Frömter o SD rat per la chirurgia UUO Anestetizzare il ratto usando isofluorano (5% di induzione, 1,5-2,5% di mantenimento), quindi radersi, lavare e disinfettare l’area chirurgica più volte con un movimento circolare con uno scrub a base di iodio o clorexidina e alcool. Applicare analgesici a lunga durata d’azione / a lento rilascio per la gestione del dolore secondo le linee guida istituzionali IACUC. Fai un’incisione lungo la linea mediana usando un bisturi; Localizzare il rene sinistro e liberarlo dagli organi peritoneali circostanti. Individuare con cura il peduncolo renale, che comprende l’arteria renale, la vena renale e l’uretere. Separare l’uretere dalle altre strutture, prendendo precauzioni per non danneggiare la delicata struttura. Usando una pinza sottile, avvolgere con attenzione una sutura 3-0 attorno all’uretere e legarla, facendo attenzione a non strapparla. Ripetere questa procedura di alcuni millimetri su entrambi i lati del primo nodo per legare un secondo nodo e assicurare l’ostruzione completa. Una volta completata la procedura, chiudere con attenzione gli strati muscolari successivi. Prima di chiudere lo strato finale, aggiungere 2 ml di soluzione salina calda e sterile allo 0,9% nell’addome prima di chiuderlo completamente. Chiudere la pelle esterna con graffette chirurgiche. Applicare analgesici a lunga durata d’azione / a lento rilascio per la gestione del dolore e osservare attentamente il recupero secondo le linee guida istituzionali IACUC. Monitorare periodicamente in seguito e prepararsi per l’imaging alla fine della quinta settimana. 2. Sintesi dell’albumina sierica del ratto rosso del Texas (TR-RSA) Pesare 100 mg di albumina sierica di ratto e scioglierla in 6,67 ml di tampone bicarbonato di sodio 0,1 M a pH 8,4 in un tubo conico da 50 ml. A una fiala da 5 mg di Texas Red-X-succinimidyl ester, aggiungere 100 μL di dimetil formammide (DMF, alta qualità) e vortice fino a quando tutto il colorante è sciolto. Posizionare la soluzione di albumina sierica di ratto su un vortice con un’impostazione bassa/media, in modo che il volume della soluzione giri ben al di sotto della parte superiore del tubo aperto. Aggiungere il colorante sciolto mentre il tubo viene vortexato. Prendere il tubo conico da 50 ml, avvolgerlo in un foglio, posizionare il tubo su qualsiasi bilanciere o rullo e agitare lentamente per 1 ora a temperatura ambiente (RT). In un secchio da 5 L di NaCl allo 0,9% con una barra di agitazione delicata, bagnare le membrane di un dializzatore cut-off adatto a peso molecolare da 50 kDa (una membrana con clip, tubi a membrana chiusi o cassette di dialisi sono tutti adatti). Caricare la soluzione TR-RSA nel sistema a membrana e collegarla agli accessori di flottazione tipicamente inclusi nel sistema. Introdurre il contenitore da 5 L con la soluzione salina allo 0,9% / TR-RSA per una notte a 4 °C (in una cella frigorifera) agitando delicatamente su una piastra di agitazione. Cambiare la soluzione di dialisi almeno tre volte nelle successive 36 ore. Il gonfiore della membrana aumenterà il volume della soluzione TR-RSA ormai chiara. Dividere i 100 mg originali per il volume per ottenere una concentrazione approssimativa: il rapporto colorante:proteina sarà 1:1. Aliquote in volumi idonei e liofilizzare per la conservazione a lungo termine. 3. Preparazione per l’imaging intravitale a 2 fotoni su un microscopio invertito Rimuovere il coperchio di un piatto inferiore coprislip da 50 mm (con diametro del coprislip di 40 mm) e posizionare 8 pezzi di nastro adesivo sul fondo interno lungo il bordo. Crea una finestra vuota a forma di piramide, utilizzando 4 pezzi per lato per consentire al rene esteriorizzato di adattarsi perfettamente a questo spazio mantenendo il contatto periferico con il nastro dell’autoclave, contribuendo così a ridurre al minimo il movimento. Regolare la spaziatura in base alle dimensioni del ratto per assicurare il miglior contatto con il rene. Posizionare 1 tampone termico su ciascun lato del piatto inferiore del coperchio da 50 mm. Assicurati che il pad riscaldante copra il palco. Utilizza un obiettivo di immersione in acqua 40x con zoom 0,75x e zoom 1,5x per generare immagini 30x e 60x, rispettivamente, consentendo immagini con ingrandimento inferiore e superiore. Se necessario, aggiungere acqua all’obiettivo utilizzando una siringa da 1 mL con un lungo pezzo di tubo PE-200 che può raggiungere la parte superiore dell’obiettivo con un angolo verso il basso per evitare l’assorbimento della goccia d’acqua lungo il tubo. Utilizzare una trasmissività laser al 2%, con rilevatori blu, verdi e rossi impostati su livelli predeterminati per garantire la coerenza delle immagini tra gli studi. Impostare la lunghezza d’onda di eccitazione a 800 nm sul laser di riferimento (vedere la tabella dei materiali), che ecciterà in modo efficiente tutti i fluorofori utilizzati in questo studio.Utilizzare rivelatori esterni (non scansionati) per raccogliere le emissioni blu utilizzando un tubo fotomoltiplicatore (PMT) (420-490 nm, guadagno 950). Utilizzare un rilevatore Hyd per catturare le emissioni verdi (500-550 nm, guadagno 100). Utilizzare un rilevatore Hyd per catturare le emissioni rosse (590-660 nm, guadagno 200). Regolare l’offset nel PMT (emissioni blu) in modo che solo pochi pixel nelle aree vuote del tessuto abbiano un valore pari a zero.NOTA: I rivelatori HyD per le emissioni verdi e rosse hanno regolazione automatica dell’offset; Solo il guadagno può essere impostato. Imposta la profondità di bit su 12 bit per dare alle immagini una scala di intensità di 4.096 tra bianco e nero.NOTA: È necessario impostare i limiti inferiori dei rivelatori (offset in PMT) per non escludere questi valori per garantire la raccolta delle emissioni a bassa intensità all’interno dello spazio di Bowman. Se l’impostazione di sensibilità è troppo bassa, i marcatori di avviso visivi lo indicheranno; A questi valori viene assegnato un valore di intensità pari a zero. Diluire circa 6 mg di albumina sierica Texas-Red-X-Rat ad un volume totale di 1 ml, caricare la soluzione in una siringa da 1 mL e posizionarla sul catetere endovenoso a permanenza nel punto 4.1 dopo l’infusione di Hoechst 33342 nel punto 9.1. 4. Preparazione chirurgica per l’imaging intravitale a 2 fotoni Posizionare il ratto pre-anestetizzato con una linea di accesso venoso permanente (femorale o giugulare) su un lato con il fianco sinistro rasato rivolto verso l’alto piatto e dritto sul tavolo. Assicurati che le zampe anteriori si tocchino, così come le zampe posteriori. Palpare delicatamente il fianco sinistro appena sotto le costole per sentire il rene per determinare la posizione naturale nell’addome. Se necessario, traccia una linea usando un pennarello permanente lungo l’area rasata, tagliando in due il centro del rene in un orientamento naso-coda. Utilizzando un paio di pinze dentate, afferrare la pelle e sollevarla verso l’alto per facilitare il pizzicamento della linea marcatrice permanente con un paio di emostatici per schiacciare la vascolarizzazione sottostante e prevenire il sanguinamento quando si effettua l’incisione con un paio di forbici chirurgiche. Ripetere questa operazione per il sottile strato muscolare esterno per ridurre al minimo il sanguinamento. Per fare l’incisione finale del sottile strato muscolare addominale interno, rimontare il rene per stimare le dimensioni e la posizione. Sollevare con attenzione lo strato muscolare interno con un paio di pinze e schiacciare una linea che taglia in due la pelle sopra il rene con gli emostatici che è circa 1/3della dimensione stimata del rene. Mantenendo la presa sullo strato muscolare con la pinza, fare l’incisione finale.NOTA: È meglio fare un’incisione più piccola ed espandersi secondo necessità piuttosto che renderla troppo grande, che richiederà una chiusura parziale con una sutura. Afferrare delicatamente il rene dal grasso circostante. Usando entrambe le mani con una pinza in ciascuna mano, lavora per afferrare il grasso al polo inferiore del rene usando una tecnica hand-over-hand per afferrare e trattenere il grasso del rene, lavorando verso il basso. Avendo una presa salda sul grasso al polo inferiore del rene con una mano, tirare delicatamente il grasso e, se necessario, spremere molto delicatamente il rene attraverso l’incisione. Se il rene non passa facilmente, allargare l’incisione. 5. Posizionamento del ratto per l’imaging Posizionare con cautela il rene esposto contro il bordo del piatto, con una leggera rotazione in modo che il lato addominale del rene entri in contatto con il coprislip e il lato dorsale sia rivolto lontano dal bordo. Per ridurre ulteriormente il movimento, prendere due garze sterili 2 x 2, inumidirli con soluzione salina e imballarli contro il lato dorsale del rene, rafforzando il contatto del lato addominale del rene al bordo. Guarda attraverso l’oculare del microscopio sotto l’illuminazione a epifluorescenza usando un cubo di rodamina / FITC a doppio passaggio. Se viene rilevato un movimento, apportare piccole regolazioni alla posizione e regolare attentamente la garza, assicurandosi che non spinga sotto il rene. Per ridurre ulteriormente il movimento, arrotolare leggermente il topo, in modo che il torace sia più lontano dal piatto. 6. Acquisizione di immagini per analisi quantitative Scansionare la superficie del rene utilizzando l’illuminazione a epifluorescenza (passo 5.3) e contrassegnare la posizione dei glomeruli utilizzando il software associato al controller di scena motorizzato (una caratteristica dei sistemi moderni). Per ogni canale di colore sotto illuminazione a 2 fotoni, prendi un volume 3D poco profondo della parte superiore di ciascun glomerulo marcato, che fungerà da immagini di sfondo. Utilizzare una tavolozza di pseudocolori nell’opzione di visualizzazione del software di imaging per visualizzare meglio le deboli intensità della fluorescenza di fondo degli anelli capillari glomerulari. Utilizzando un vaso sanguigno superficiale come punto focale, infondere lentamente l’albumina fluorescente, lasciando il tempo di osservare l’aumento e la caduta della fluorescenza dovuta alla distribuzione sistemica. Infondere abbastanza TR-RSA per ottenere un’intensità nella vascolarizzazione peritubulare e nelle anse capillari che è appena al di sotto della saturazione.NOTA: C’è tipicamente un ritardo di 5 s tra l’infusione di materiale e la sua comparsa nel flusso sanguigno quando la perfusione renale è normale. Attendere circa 10 minuti prima di acquisire volumi 3D (intervalli di 1 μm) per tutti i glomeruli contrassegnati e visualizzati dal punto 6.2.NOTA: I ratti Wistar di Monaco di Simonsen hanno meno glomeruli superficiali. Tuttavia, poiché il ceppo Frömter dei ratti MW ha un numero maggiore di glomeruli superficiali, è spesso possibile visualizzare fino a 10 glomeruli. Eutanasia il ratto attraverso un sovradosaggio di isoflurano alla fine dello studio. Eseguire una doppia pneumotoracotamia per garantire l’eutanasia. 7. Calcolo della permeabilità glomerulare Utilizzando il software di visualizzazione delle immagini associato al sistema di microscopio, esportare le immagini in immagini raw a 12 bit per l’elaborazione e l’analisi. Caricare i volumi 3D di sfondo e il volume 3D grezzo contenente l’albumina fluorescente circolante. Individua il piano focale nel volume 3D con il loop capillare superficiale più luminoso nei glomeruli con spazio sufficiente sul bordo della capsula di Bowman circostante. Utilizzando punti di riferimento visivi, individuate lo stesso piano focale trovato nel volume di sfondo. Seleziona una regione nel loop capillare e una all’interno dello spazio del Bowman notando i valori medi di intensità di ciascuno. Utilizzare questi valori di intensità come valori di sfondo. Delinea una regione (almeno 20 x 20 pixel di area) all’interno dello spazio del Bowman nell’immagine contenente albumina e nota la lettura dell’intensità (seleziona un’area che non sia adiacente a un anello capillare o alla capsula di Bowman per assicurare la misurazione più pulita delle intensità dello spazio di Bowman). Sposta la regione disegnata su altre due regioni per ottenere un valore medio per l’intensità media all’interno dello spazio di Bowman. Selezionare l’intensità fluorescente al plasma più brillante all’interno della sezione del ciclo capillare e cerchiare questa regione. Utilizzando la funzione di soglia , evidenziare i valori luminosi (di solito situati ai bordi delle pareti dell’anello capillare), evitare ombre RBC circolanti e registrare il valore.NOTA: Poiché i fattori all’interno del sangue causano una sottostima dei livelli di fluorescenza plasmatica, è importante selezionare le aree più luminose. Inserisci i valori in un foglio di calcolo per calcolare l’SGC utilizzando l’equalizzazione (1):SGC = (1) 8. Calcolo del flusso di globuli rossi nelle anse capillari glomerulari superficiali e nella vascolarizzazione renale utilizzando una funzione linescan Trova una nave appropriata (un’ansa capillare o una nave peritubulare). Poiché la funzione linescan nel software di acquisizione delle immagini di riferimento (vedere la tabella dei materiali) richiede che il recipiente sia perpendicolare, ruotare l’immagine utilizzando la funzione di rotazione . Una volta che il recipiente è ruotato e disteso, selezionare la funzione XT nel menu di acquisizione . Impostare la scansione di 4.000 linee. Posizionare la linea attraverso la nave da esaminare; Assicurarsi che il piano focale sia al diametro massimo del segmento da riprendere. Fare clic con il pulsante sinistro del mouse sull’immagine composita a colori e selezionare Scatta istantanea per generare un’immagine di riferimento dell’area in cui è stata eseguita la scansione delle linee. Fare immediatamente clic sul pulsante Start per acquisire la scansione delle linee della nave. Per determinare la portata RBC, importare i linecan nel software di elaborazione delle immagini (vedere la tabella dei materiali). Aprire la finestra di dialogo Mostra statistiche regione nel menu a discesa Misura . Selezionate lo strumento di disegno a linea singola e disegnate una linea che corrisponda alla pendenza delle ombre RBC. Prendere nota dei valori di larghezza e altezza.NOTA: i valori dei pixel ottenuti per la larghezza corrisponderanno alla distanza; I pixel per l’altezza corrispondono al tempo. Utilizzare la seguente formula (Eq (2)) per calcolare la velocità.Portata RBC in μm/s = (2)NOTA: Questo corrisponde ai parametri di acquisizione con ingrandimento 60x e una frequenza di scansione di 400 Hz con il microscopio di riferimento (vedere la Tabella dei materiali).Fai almeno cinque calcoli e fai la media per riportare la velocità per ogni linea.NOTA: Questi parametri dipenderanno dalla dimensione dei pixel e dalla velocità di acquisizione del sistema del microscopio. 9. Calcolo dell’occlusione dei globuli bianchi nelle anse capillari glomerulari Somministrare la colorazione nucleare Hoechst 33342 (a ~8 μg/kg di peso ratto) attraverso una linea di accesso venoso permanente per identificare i globuli bianchi depositati nelle anse capillari.NOTA: La profondità utilizzabile sarà limitata a causa della dispersione di fotoni e dell’assorbimento da parte dell’emoglobina, specialmente per le emissioni blu a lunghezza d’onda più corta. Centrare un glomerulo nel campo di imaging e prendere un set di dati 3D a partire dalla superficie glomerulare e terminare i dati almeno 30-35 μm. Utilizzare una dimensione di passo di 1 μm nella direzione Z. Identificare i globuli bianchi confrontando il canale blu di Hoechst con il canale dell’albumina rossa del Texas; cercare l’esclusione del colorante rosso nell’ansa capillare e una corrispondente colorazione nucleare per identificare positivamente i globuli bianchi. Definire i globuli bianchi come “aderiti” se appaiono statici su 3 sezioni ottiche. Riportare i valori come occorrenza/10 sezioni ottiche dalla parte superiore del glomerulo, prese ad intervalli di 1 μm. 10. Segnare la presenza di formazioni di Rouleaux nei glomeruli superficiali Seguire le stesse istruzioni per il passaggio 9.3 e acquisire un set di dati 3D. Cerca le formazioni di Rouleaux che appaiono come globuli rossi impilati in pacchetti che resistono alla dissociazione mentre si muovono lungo le anse capillari. Utilizzare un fluoroforo rosso per una migliore visualizzazione della struttura a profondità maggiori grazie alla minore dispersione di fotoni per le emissioni rosse a lunghezza d’onda più lunga. Riportare i valori come occorrenza/25 sezioni ottiche dalla parte superiore del glomerulo, prese ad intervalli di 1 μm. 11. Isolamento dei glomeruli Isolare tre gruppi di glomeruli dai reni freschi utilizzando una tecnica di setacciatura standard che si traduce in una purezza vicina al 90% dei glomeruli di ratto15.Posizionare la corteccia renale in soluzione salina tamponata con fosfato freddo (PBS) e tritarla usando più forbici sottili o lamette da barba. Aggiungere il tessuto tritato a un filtro per cellule sterili da 100 μm e spingerlo delicatamente utilizzando uno stantuffo per siringhe da 5 ml e 50-100 ml di PBS freddo.NOTA: La maggior parte dei tubuli vengono trattenuti mentre i glomeruli passano attraverso. Posizionare la frazione glomeruli arricchita su un filtro da 70 μm e lavarli ampiamente con PBS freddo. Lavare il filtro con 100-200 ml di PBS freddo per rimuovere la maggior parte dei tubuli rimanenti. Raccogliere i glomeruli dal filtro utilizzando 1-2 ml di PBS freddo, centrifugare (10.000 × g, 2 min, 4 °C) e congelarli in azoto liquido fino all’isolamento dell’RNA.NOTA: La purezza glomerulare determinata al microscopio a contrasto di fase è del >90% e la resa è di circa 10 mg da 2 reni. 12. Isolamento dell’RNA glomerulare Omogeneizzare il pellet di glomeruli congelato utilizzando il reagente di isolamento dell’RNA aggiungendo 400 μL del reagente e rompendo il pellet utilizzando una punta di pipetta da 200 μL, seguita da un breve vortice e 5 minuti di incubazione a RT16. Aggiungere 40 μL di 1-bromo-3-cloropropano (BCP), vortice per 15 s e tenere premuto RT per 15 minuti. Centrifugare a 12.000 × g, 15 min, 4 °C. Rimuovere lo strato acquoso, diluire lo strato inferiore con un volume uguale di etanolo al 70% e caricarlo direttamente su una colonna di rotazione (vedere la tabella dei materiali). Dopo i lavaggi, ciascuno consistente nell’aggiungere la rispettiva soluzione alla colonna seguita da centrifugazione a 12.000 x g, 15 s, 26 °C [3 totali, primi 2 con 500 μL di RPE (tampone di lavaggio delicato proprietario con etanolo per rimuovere tracce di sali, 3° lavaggio con 500 μL di 80% EtOH], eluire l’RNA mediante l’aggiunta di 15 μL di H2 O e centrifuga, come per i lavaggi. Controllare la concentrazione e la purezza dell’RNA e trasportare i campioni di RNA alla struttura principale per l’analisi delle nanostringhe17,18.NOTA: La resa totale dell’RNA è di circa 1-2 μg. Qui, i 24 campioni contenevano 200 ng di RNA a 30 ng/μL. 13. Analisi delle nanostringhe NOTA: La tecnologia delle nanostringhe si basa sul rilevamento digitale e sul codice a barre molecolare diretto di molecole bersaglio che utilizzano coppie di sonde codificate a colori. La sonda Capture trasporta una porzione di biotina all’estremità 3′ e la sonda Reporter trasporta il segnale alla sua estremità 5′. Spedire le coppie di sonde genetiche Nanostring e i CodeSet alla Genomic Core Facility dello Stato del Michigan e utilizzarli come indicato da NanoString.NOTA: ci sono sei posizioni per i codici colore e ogni posizione può essere uno dei quattro colori, consentendo una grande varietà di tag che possono essere risolti individualmente e identificati durante la raccolta dei dati. Ottenere i dati raccolti dal personale della struttura Genomic Core utilizzando l’analizzatore proprietario Nanostring nCounter Digital, che raccoglie i campi visivi utilizzando un obiettivo al microscopio e una telecamera CCD e tabula e visualizza i conteggi dei codici a barre. Importa i dati grezzi nel software nSolver di Nanostring per l’analisi. Normalizzare i dati normalizzati utilizzando le impostazioni predefinite e confrontare i dati tra i gruppi come descritto nel manuale.NOTA: L’obiettivo era monitorare i cambiamenti genetici precedentemente dimostrati alterati nel tessuto corticale da un modello UUO19, malattia renale 17,20,21,22,23,24,25,26. Un totale di 126 geni, inclusi i controlli positivi e negativi raccomandati, sono stati analizzati in ciascun gruppo glomeruli (CONT, SHAM E UUO).

Representative Results

Tre gruppi di glomeruli sono stati isolati utilizzando una tecnica di setacciatura standard che si traduce in una purezza vicina al 90% dei glomeruli di ratto15. Il primo gruppo glomeruli proveniva dal rene sinistro di ratti SD sottoposti a morsetto dell’uretere renale sinistro per 5 settimane, UUO (5 maschi, 3 femmine). Il secondo gruppo glomeruli è stato isolato dal rene di controllo controlaterale dello stesso ratto, CONT (5 maschi, 3 femmine). Il terzo gruppo di glomeruli è stato isolato da ratti SD sottoposti a chirurgia SHAM e il rene sinistro è stato utilizzato per l’isolamento dei glomeruli dopo 5 settimane, SHAM (4 maschi, 4 femmine). Alterazioni morfologicheL’esternalizzazione del rene ostruito per l’imaging ha rivelato un rene grossolanamente allargato, circa quattro volte la dimensione normale, con epiteli sottili visibili attraverso l’interno del rene pieno di liquido. Attraverso un obiettivo 20x, utilizzando l’illuminazione a epifluorescenza e un cubo a doppio passaggio FITC/Rhodamina, il cambiamento più evidente è stato l’assottigliamento degli epiteli tubulari e il collasso uniforme dei lumi tubulari lungo l’intera lunghezza tubolare. L’istologia è stata ben descritta ed è grave entro una settimana di UUO10,11,12. Il numero di glomeruli visibili in superficie nei ratti MWF e SD è aumentato dopo cinque settimane di ostruzione unilaterale dell’uretere. Nella Figura 1A viene illustrato il metodo utilizzato per creare il modello UUO. Il rene destro non è toccato e fornisce un’adeguata velocità di filtrazione glomerulare per il ratto. Il numero di glomeruli per campo utilizzando un obiettivo 20x (363 μm x 363 μm) è stato contato e mostrato in un grafico nella Figura 1B. Il numero di glomeruli superficiali nei ratti MWF è aumentato da 1,08 ± 0,11 / campo nei ratti non trattati a 2,97 ± 0,65 / campo nel gruppo UUO di cinque settimane. I ratti SD sono passati da non avere glomeruli superficiali a 2,02 ± 0,37 / campo dopo 5 settimane di UUO. Immagini intravitali a 2 fotoni sono state prese di questi ratti dopo l’iniezione con TR-RSA (rosso), un destrano blu a cascata da 10 kDa (10 kDa-CB) e Hoechst 33342 per marcare i nuclei (ciano). Questi sono mostrati per ratti MWF normali (Figura 1C), ratti MWF dopo cinque settimane di UUO (Figura 1D) e ratti SD dopo cinque settimane di UUO (Figura 1E). Queste immagini evidenziano alterazioni drammatiche che si verificano negli epiteli tubolari. I lisosomi tubuli prossimali, che normalmente sono piccoli accumuli punteggiati di colore arancione nei ratti MWF e SD non trattati, diventano grandi strutture vacuolari singolari che riempiono la maggior parte della cellula tubulare rimpicciolita. Come delineato dall’albumina TR-RSA, la vascolarizzazione appariva raddrizzata, e in molti vasi, priva di globuli rossi fluenti, mostrando solo plasma in streaming. La fissazione dei reni ha rivelato che la corteccia si era assottigliata in una pelle fibrosa non più spessa di un millimetro. Queste osservazioni concordano con la letteratura antica che utilizza questo modello 3,10,11,12. Alterazioni della dinamica vascolare renale e della permeabilità glomerulareIl flusso ematico renale è stato significativamente ridotto in entrambi i gruppi MWF UUO e SD di cinque settimane rispetto ai ratti non trattati (Figura 2). I ratti MWF operati da sham avevano una portata peritubulare RBC di 885 ± 25 μm/s. Il flusso peritubulare dei globuli rossi nei ratti UUO MWF e SD a cinque settimane è diminuito rispettivamente a 250 ± 100 μm/s e 200 ± 125 μm/s. Questi valori sono stati calcolati raccogliendo scansioni di linea attraverso i vasi peritubulari per calcolare la velocità dei globuli rossi. La Figura 2D mostra un grafico di questi dati. La velocità dei globuli rossi all’interno dei loop capillari glomerulari è stata significativamente ridotta nei ratti UUO MWF e SD a cinque settimane rispetto al MWF non trattato (Figura 3). In molti casi, i glomeruli sono risultati avere anse capillari completamente prive di globuli rossi fluenti. Le portate dei globuli rossi ad anello capillare erano rispettivamente 1.405 ± 425 μm/s, 250 ± 220 μm/s ± e 190 ± 200 μm/s o MWF non trattati, MWF UUO a cinque settimane e ratti UUO SD a cinque settimane (Figura 3D). All’interno dei circuiti capillari dei gruppi UUO di cinque settimane, il flusso lento dei globuli rossi ha rivelato la presenza di globuli bianchi aderenti, rallentando il flusso o bloccandolo, con solo il flusso di plasma visualizzato a valle dell’ostruzione parziale o totale. Per quantificare questa osservazione, il numero di globuli bianchi aderenti trovati in un volume 3D è stato contato e quindi normalizzato all’occorrenza per ogni 10 μm di profondità del volume 3D. La struttura del globulo bianco aderente poteva essere individuata usando la fluorescenza del colorante nucleare ciano di Hoechst 33342. Sfortunatamente, la maggiore dispersione di fotoni delle luci che emettono blu limitava l’identificazione affidabile dei globuli bianchi dai loro nuclei alle 10 sezioni ottiche superiori dall’alto, prese a passi di 1μm di volume glomerulare. I ratti MWF non trattati avevano meno di 0,125 ± 0,05 WBC / 10 sezioni ottiche dall’alto, prese a passi di 1 μm di volume, mentre questo numero è aumentato a 1,5 ± 0,5 e 3,25 ± 0,7 rispettivamente in ratti UUO MWF a 5 settimane e UUO SD a 5 settimane (Figura 3E). Un’altra alterazione vascolare che può anche spiegare la riduzione del flusso di globuli rossi nei gruppi UUO di 5 settimane è stata la comparsa regolare di formazioni di Rouleaux (globuli rossi raggruppati che sono aderenti in una configurazione “moneta impilata”, vedi inserto della Figura 3F). Le formazioni di Rouleaux scorrono più lentamente e possono essere fermate da un WBC aderente. I ratti WMF non trattati non hanno praticamente formazioni di Rouleaux nei loro capillari glomerulari, avendo solo 0,05 ± 0,05 occorrenze per 25 sezioni ottiche dall’alto, prese a passi di 1 μm. I ratti UUO MWF e SD a cinque settimane hanno avuto un marcato aumento delle formazioni di Rouleaux 2,27 ± 0,46 e 1,46 ± 0,73 per 25 sezioni ottiche a partire dall’alto, prese a passi di 1 μm, rispettivamente (Figura 3F). Oltre alla riduzione delle portate glomerulari dei globuli rossi osservata con UUO, è stato osservato un aumento della permeabilità all’albumina. C’era una maggiore eterogeneità nella permeabilità all’albumina tra i glomeruli. Occasionalmente, l’accumulo di albumina all’interno dello spazio di Bowman era abbastanza intenso da essere chiaramente visibile (Figura 4B, asterisco). Il coefficiente di setacciatura glomerulare dell’albumina è aumentato da 0,015 ± 0,002 nei MWF non trattati, a 0,045 ± 0,05 in MWF UUO a 5 settimane e 0,052 ± 0,075 nei ratti UUO SD a cinque settimane. Alterata funzione del tubulo prossimaleÈ interessante notare che l’albumina filtrata non può essere rilevata nelle cellule tubuli prossimali dopo UUO. Il segmento S1 normalmente endocita grandi quantità di albumina27,28,29,30, come mostrato qui in condizioni fisiologiche in ratti MWF non trattati (Figura 5A). Questo stesso assorbimento non è stato visto nel MWF o SD PT dopo 5 settimane di UUO (Figura 5B, C). I tubuli prossimali che circondano i glomeruli ripresi tra 45 e 60 minuti dopo l’infusione di TR-RSA sono stati valutati per presenza (1) o assenza (0) di albumina. È importante notare che in condizioni fisiologiche, il segmento S1 si lega avidamente e interiorizza l’albumina con poca o nessuna albumina che raggiunge i tubuli distali o i dotti di raccolta. Pertanto, è ovvio che questi ultimi segmenti tubuli prossimali potrebbero non contenere albumina con conseguente positività frazionaria per l’assorbimento di albumina inferiore a 1,0. La Figura 5D mostra un grafico con i risultati del punteggio dell’assorbimento dell’albumina tubulare prossimale. MWF non trattato aveva un valore di assorbimento frazionario del tubulo prossimale di 0,556 ± 0,126. Sia i ratti UUO MWF che SD a cinque settimane avevano valori significativamente più bassi di 0,049 ± 0,126 e 0,00 ±0,00, rispettivamente. Gli studi sono stati completati anche in ratti MWF UUO a 12 settimane (Tabella 1). Dodici settimane di UUO è il tempo standard utilizzato per gli studi sui topi per indurre glomeruli superficiali. Sono stati fotografati tre ratti maschi UUO e la densità glomerulare è aumentata ulteriormente a 6,16 ± 1,83 glomeruli per campo 20x in questi ratti. La portata dei globuli rossi era di 293 ± 67 μm/s, l’adesione del WBC era di 1,47 ± 1,12, entrambi simili ai dati UUO a 5 settimane. Anche l’SGC dell’albumina è aumentato rispetto ai ratti UUO a 5 settimane a 0,109 ± 0,04. Alterazioni dell’mRNA glomerulare indotte dall’UUO cronicoLa tabella 2 mostra tutti i geni (sonde) con i loro valori di espressione raggruppati e di deviazione standard. Nota, i geni sono stati selezionati per l’analisi sulla base di precedenti documentazioni di alterazione della malattia renale, incluso UUO come descritto nella nota della sezione 13 del protocollo. La figura 6 è una mappa termica dei dati che evidenziano i drammatici cambiamenti nell’espressione genica per la maggior parte dei geni nei glomeruli UUO rispetto ai glomeruli di controllo o fittizi. Figura 1: Aumento del numero di glomeruli superficiali e induzione di glomeruli superficiali nei ratti SD dopo UUO di 5 settimane nei ratti MWF. (A) Un diagramma chirurgico dell’uretere sul rene sinistro accuratamente liberato dall’arteria renale e dalla vena prima di essere occluso con due legami usando la sutura chirurgica. (B) Un grafico che indica l’aumento del numero di glomeruli superficiali presenti nei ratti MWF prima e cinque settimane dopo l’UUO insieme al numero di glomeruli di superficie nei ratti SD, che normalmente non hanno glomeruli superficiali. Il numero di glomeruli superficiali nei ratti MWF è aumentato da 1,08 ± 0,11 / campo nei ratti non trattati a 2,97 ± 0,65 / campo nel gruppo UUO di 5 settimane. I ratti SD sono passati dall’assenza di glomeruli superficiali a 2,02 ± 0,37 / campo. Le immagini tridimensionali ricostruite mostrano la superficie renale per MWF (C) non trattato, MWF dopo UUO (D) di 5 settimane e SD dopo UUO (E) di cinque settimane. Si noti la comparsa di grandi strutture vacuolari arancioni che si sono fuse da piccoli lisosomi individuali in grandi corpi anormali. L’UUO di 5 settimane nei ratti SD non ha portato ad aree simili ai normali epiteli tubulari osservati in C e parzialmente in D. La vascolarizzazione appariva raddrizzata in alcune regioni e, in molte, presentava occlusioni parziali che permettevano al plasma ma non ai globuli rossi di fluire. (n = 3 ratti maschi per gruppo) Barre della scala = 40 μm. Le barre di errore indicano una deviazione standard. Abbreviazioni: UUO = ostruzione ureterale unilaterale; SD = Sprague-Dawley; MWF = Monaco di Baviera Wistar Frömter; G = glomerulo; RBC = globuli rossi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 2: Riduzione del flusso di globuli rossi all’interno della vascolarizzazione peritubulare superficiale dopo 5 settimane di UUO. I linecan sono stati raccolti nei vasi sanguigni peritubulari per determinare la velocità del flusso dei globuli rossi in μm/s. In breve, le linee di riferimento rosse mostrate in A, B e C rappresentano una piccola regione in cui la stessa area di larghezza pixel è stata scansionata ripetutamente e le immagini impilate in una colonna per visualizzare la distorsione causata dai globuli rossi che fluiscono, che viaggiano più velocemente di quanto il microscopio possa acquisirli. La colonna adiacente alla figura di riferimento è la linescan, con la pendenza della distorsione RBC utilizzata per calcolare la velocità (asse x = distanza e asse y = tempo). Qui, pendenze progressivamente più ripide corrispondono a velocità RBC più lente poiché rimangono più a lungo nella regione linecan. Si noti la differenza nell’aspetto dei globuli rossi nei ratti MWF non trattati (A) rispetto alle immagini UUO di cinque settimane per i ratti MWF (B) e SD (C). Le velocità di flusso dei globuli rossi per i tre gruppi di ratti sono mostrate in D. Il flusso di RBC peritubulari nei MWF non trattati è stato in media di 885 ± μm/s. Questi valori sono diminuiti significativamente cinque settimane dopo UUO nei ratti MWF e SD a 250 ± 100 μm / s e 200 ± 125 μm / s, rispettivamente. Barra della scala = 20 μm, n = 3 ratti maschi per gruppo. Le barre di errore indicano una deviazione standard. Abbreviazioni: UUO = ostruzione ureterale unilaterale; SD = Sprague-Dawley; MWF = Monaco di Baviera Wistar Frömter; RBC = globuli rossi; WBC = globuli bianchi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 3: Riduzione significativa del flusso glomerulare dei globuli rossi dell’ansa capillare e attivazione indotta dell’adesione dei globuli bianchi mediante UUO a 5 settimane. Lo stesso approccio linecan utilizzato per determinare il flusso pertubulare dei globuli rossi è stato utilizzato per studiare le alterazioni del flusso sanguigno capillare glomerulare. I pannelli A, B e C mostrano un layout simile a quello della Figura 2 e si concentrano su un glomerulo rispettivamente in MWF sham-operated, MWF UUO a cinque settimane e SDs UUO a cinque settimane. (D) Un grafico che rivela la portata fisiologicamente elevata dei globuli rossi nei circuiti capillari di ratti MWF operati con una media di 1.405 ± 425 μm/s ± 425, scesa a 250 ± 220 μm/s e 190 ± 200 μm/s rispettivamente per i ratti UUO MWF a 5 settimane e UUO SD a 5 settimane. Durante l’esame delle anse capillari glomerulari, i globuli bianchi aderenti erano facilmente visibili mentre si concentravano attraverso il glomerulo. Sono state prese sezioni ottiche tridimensionali di singoli glomeruli e le prime 10 sezioni ottiche, distanti 1 μm, per misurare il numero di globuli bianchi aderenti. I ratti MWF non trattati non avevano praticamente globuli bianchi visibili nei loro volumi, con una media inferiore a 0,125 ± 0,05 WBC / 10 sezioni ottiche dall’alto, prese a passi di 1μm. Nei ratti UUO MWF e SD a 5 settimane, questi numeri sono aumentati a 1,5 ± 0,5 e 3,25 ± 0,7 WBC / 10 sezioni ottiche dall’alto, prese a passi di 1 μm, rispettivamente. Questi risultati sono mostrati nel grafico nel pannello E, con inserti colorati che mostrano i globuli bianchi che occludono gli anelli capillari. Le formazioni di Rouleaux (frecce, inserite nel pannello F) appaiono come globuli rossi strettamente legati insieme in una configurazione a “moneta impilata” che mantiene in gran parte il loro raggruppamento raggruppato anche nella turbolenza del flusso sanguigno. Queste strutture patologiche erano facilmente distinguibili a profondità maggiori all’interno del glomerulo. I ratti MWF gestiti da sham erano in gran parte privi di queste strutture, avendo solo 0,05 ± 0,05 occorrenze a 25 sezioni ottiche dall’alto, prese a passi di 1 μm di volume glomerulare. Al contrario, l’UUO a 5 settimane in entrambi i ratti MWF e SD ha avuto un marcato aumento delle formazioni di Rouleaux con occorrenze di 2,27± 0,46 e 1,46 ± 0,73/25 sezioni ottiche dall’alto, prese a passi di 1 μm, rispettivamente. Barre della scala = 20 μm, n = 3 ratti maschi per gruppo. Le barre di errore indicano una deviazione standard. Abbreviazioni: UUO = ostruzione ureterale unilaterale; SD = Sprague-Dawley; MWF = Monaco di Baviera Wistar Frömter; RBC = globuli rossi; WBC = globuli bianchi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 4: Aumento significativo della permeabilità all’albumina capillare glomerulare dopo UUO di 5 settimane. I pannelli A, B e C mostrano immagini pseudocolorate di un volume 3D per il canale dell’albumina sierica di ratto in ratti MWF non trattati, MWF UUO a 5 settimane e UUO SD a cinque settimane, rispettivamente. Le immagini sono presentate in una tavolozza di pseudocolori per evidenziare l’apprezzabile quantità di albumina filtrata vista nello spazio di Bowman, in particolare nel pannello B (asterisco). (A) Lo spazio di Bowman (asterisco) mostra il normale livello di albumina tipicamente osservato nei ratti MWF non trattati, indiscernibile all’occhio. Le immagini dei glomeruli sono state prese prima dell’infusione di albumina per sottrarre i valori di fluorescenza di fondo da quelli prelevati dopo la somministrazione di albumina. (D) Un grafico con il coefficiente di setacciatura glomerulare per l’albumina nei ratti MWF non trattati, avente un valore di 0,015 ± 0,002. Questo valore è aumentato significativamente a 0,045± 0,05 nei ratti MWF UUO a 5 settimane e 0,052 ± 0,075 nei ratti UUO SD a cinque settimane. Questo parametro è un valore proporzionale delle intensità fluorescenti dello spazio di Bowman diviso per il valore del plasma e non ha alcuna unità di misura associata. Barra della scala = 20 μm, n = 3 ratti maschi per gruppo. La scala di intensità pseudocolore si trova sotto il pannello D. Le barre di errore indicano una deviazione standard. Abbreviazioni: UUO = ostruzione ureterale unilaterale; SD = Sprague-Dawley; MWF = Monaco di Baviera Wistar Frömter; RBC = globuli rossi; WBC = globuli bianchi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 5: Funzione ridotta nei tubuli prossimali dopo UUO di 5 settimane. (A) Un’immagine di un glomerulo superficiale e del segmento S1 da un ratto Wistar Frömter di Monaco normale prelevato 40 minuti dopo l’infusione di TR-RSA e destrano Cascade Blue. L’internalizzazione del TR-RSA può essere vista nel segmento S1 e nel tubulo prossimale. In netto contrasto, i ratti MWF (B) e i ratti SD (C), sottoposti a UUO di 5 settimane, mostrano tubuli prossimali gravemente alterati con assorbimento minimo o nullo di TR-RSA. I lisosomi autofluorescenti (A) normalmente piccoli e punteggiati diventano grandi e vacuolari giallo-arancio, spesso con un collasso completo del lume tubolare, che non può essere trovato nei set di dati tridimensionali. (C) I tubuli distali normalmente privi di qualsiasi forma di autofluorescenza contengono ora accumuli autofluorescenti. Il punteggio dei tubuli prossimali che circondano i glomeruli in immagini simili prese 45-60 minuti dopo l’infusione, per l’assorbimento di albumina, ha mostrato una differenza significativa tra il gruppo MWF finto operato ed entrambi i gruppi UUO di 5 settimane. I ratti MWF non trattati avevano un valore di assorbimento frazionario del tubulo prossimale di 0,556 ± 0,126. Sia i ratti UUO MWF che SD a cinque settimane avevano valori significativamente più bassi di 0,049 ± 0,126 e 0,00 ±0,00, rispettivamente. Barra della scala = 20 μm, n = 3 ratti maschi per gruppo. Le barre di errore indicano una deviazione standard. Abbreviazioni: UUO = ostruzione ureterale unilaterale; SD = Sprague-Dawley; MWF = Monaco di Baviera Wistar Frömter; RBC = globuli rossi; WBC = globuli bianchi; TR-RSA = albumina sierica del ratto rosso del Texas. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 6: Alterazioni dell’espressione genica con UUO . (A) Una mappa termica dei dati. (B) Cambiamenti genetici normalizzati per tutti i dati in un grafico a dispersione. L’espressione dei geni nei reni di controllo è stata tracciata da bassa ad alta espressione e i geni di entrambi i reni SHAM e UUO sono stati confrontati con i livelli di espressione di controllo. I punti di dati genici che cadono vicino al valore diagonale dei geni di controllo indicano livelli di espressione simili per entrambi i gruppi, mentre i punti dati sopra o sotto la diagonale indicano livelli di espressione più alti o più bassi, rispettivamente. Si noti che i geni SHAM si raggruppano più vicini all’espressione diagonale di controllo rispetto ai geni UUO, che sono più variabili. Abbreviazione: UUO = ostruzione ureterale unilaterale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Tabella 1: Progressione della lesione da 5 a 12 settimane di UUO. Confronto dei parametri di imaging UUO a 5 e 12 settimane in tre ratti MWF maschi e tre ratti maschi SD in ciascun punto temporale. I dati a cinque settimane sono gli stessi delle figure precedenti. Si noti l’aumento della densità glomerulare e l’SGC per l’albumina con UUO continua. Abbreviazioni: UUO = ostruzione ureterale unilaterale; SD = Sprague-Dawley; MWF = Monaco di Baviera Wistar Frömter; GSC = coefficiente di setacciatura glomerulare. Clicca qui per scaricare questa tabella. Tabella 2: Analisi dei marcatori di infiammazione nei glomeruli di UUO e ratti di controllo. Le coppie di sonde geniche e i CodeSet sono stati progettati e utilizzati come indicato da NanoString. Sono stati analizzati oltre 100 geni, oltre a controlli positivi e negativi come specificato da Nanostring. Tutti i geni (sonde) con la loro espressione raggruppata e i valori SD sono mostrati nella tabella. La Figura 6A è una mappa di calore dei dati, mentre la Figura 6B presenta i cambiamenti genetici per tutti i dati in un grafico a dispersione. Si notino le somiglianze tra i controlli e SHAM e i cambiamenti distinti per la maggior parte dei geni nell’UUO. Abbreviazioni: UUO = ostruzione ureterale unilaterale; SD = deviazione standard. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Discussion

Lo studio della fisiologia glomerulare ha visto molti approcci diversi, in particolare l’uso della micropuntura, la perfusione di glomeruli isolati e la microscopia. La disponibilità di glomeruli superficiali nei ratti Wistar di Monaco, ceppi di Fromter e Simonsen, ha permesso studi dinamici in vivo . Una nota importante per i ricercatori che adottano questa tecnologia è la necessità di impostare parametri di acquisizione per mantenere immagini coerenti tra gli studi, in modo che l’autofluorescenza nei tessuti rimanga coerente. Utilizzando un cubo di epifluorescenza a doppio passaggio di fluoresceina/rodamina e regolando le impostazioni di guadagno sui canali di emissione verde e rosso per imitare sullo schermo del computer ciò che viene visto attraverso gli oculari garantirà una firma cromatica coerente nell’autofluorescenza anche tra diversi sistemi di microscopi.

Il ceppo Fromter è stato ampiamente utilizzato in quanto ha un numero ridotto di glomeruli totali, ~ 75% normale, e i maschi sviluppano spontaneamente ipertensione a circa 12 settimane di età, con proteinuria progressiva e successiva sclerosi glomerulare focale, morendo infine di insufficienza renale12. L’uso di questi ratti e l’aggiunta della microscopia a 2 fotoni con la sua fototossicità ridotta, una migliore profondità di penetrazione e la capacità di visualizzare più sonde fluorescenti contemporaneamente hanno aperto la strada a nuove scoperte 1,4,5. Con lo sviluppo dell’hardware e del software del computer, i dati quantitativi sono ora lo standard per tutti i laboratori a 2 fotoni. Molteplici tecniche quantitative sono state sviluppate e applicate ai processi glomerulari, tubuli prossimali, vascolari e interstiziali in condizioni fisiologiche e patologiche 1,4,5,27,28,29,30.

Le strutture di generazione di topi transgenici hanno aggiunto una nuova dimensione allo studio della fisiologia e della patologia renale, ed era solo una questione di tempo prima che questo fosse combinato con la microscopia a 2 fotoni per delineare ulteriormente l’importanza di specifici prodotti genici nella struttura e nella funzione renale. Tuttavia, i glomeruli di topo, tranne nei topi molto giovani, si trovano a oltre 100 μm dalla superficie del rene9. La microscopia a due fotoni viene eseguita al meglio a una profondità compresa tra 20 e 50 μm come risoluzione, e l’intensità della fluorescenza diminuisce rapidamente in seguito a causa della diffusione della luce emessa e dell’assorbimento dall’interazione con l’emoglobina. Pertanto, era necessario indurre glomeruli superficiali. L’approccio comunemente usato è un modello di ostruzione unilaterale prolungato per 12 settimane. Poiché questi modelli non consentono determinazioni di base, non è possibile separare gli effetti dell’UUO dal processo studiato.

Utilizzando ratti MWF, si può confrontare la funzione glomerulare basale con quella successiva UUO. Questo modello UUO è noto per indurre infiammazione e un rapido tasso di fibrosi ed è stato utilizzato per studiare CKD e fibrosi10,11,12. Come previsto, c’è stato un aumento dei glomeruli superficiali sia nei ratti MWF che SD. Inoltre, i risultati quantitativi ottenuti dopo UUO per i ratti MWF e SD erano molto comparabili. La riduzione del flusso sanguigno registrata qui era stata precedentemente riportata confrontando i dati microscopici dopo UUO con i dati di micropuntura3. Era anche noto che l’istologia tubulare e interstiziale è marcatamente alterata e i PT sono per lo più non funzionali, come riportato qui, con una mancanza di endocitosi dell’albumina. Gli studi in Figura 2 e Figura 3 mostrano una drastica riduzione della velocità di flusso dei globuli rossi nei capillari glomerulari e peritubulari e una maggiore adesione del WBC. Le riduzioni del flusso sono probabilmente dovute al blocco capillare dell’adesione dei globuli bianchi e delle formazioni di rouleaux.

Per valutare ulteriormente l’infiammazione, abbiamo quantificato la permeabilità all’albumina e abbiamo dimostrato che aumenta di dieci volte. Inoltre, glomeruli isolati hanno mostrato che l’espressione di mRNA è aumentata per molti geni precedentemente noti per essere aumentati nell’infiammazione renale in una varietà di stati di malattia renale 17,19,20,21,22,23,24,25,26 . Gli aumenti della densità superficiale glomerulare e della permeabilità all’albumina sono stati progressivi, come mostrato dai dati UUO a 12 settimane. I dati attuali sono i primi a mostrare direttamente che i glomeruli subiscono danni strutturali significativi, infiammazione e cambiamenti molecolari nel modello UUO. I risultati sono coerenti con uno studio precedente sul tessuto renale intero che ha analizzato le biopsie renali delle pecore dopo UUO, trovando più marcatori di infiammazione elevati19. I risultati attuali indicano che esiste una marcata infiammazione all’interno dei glomeruli, precedentemente noti solo per il tessuto corticale.

I dati attuali differiscono da studi precedenti su topi in cui non sono stati trovati cambiamenti nell’espressione della molecola di adesione, nella deposizione del complemento e nell’infiltrazione dei neutrofili tra i glomeruli postidronefrosi postidronefrosi di 12 settimane e i glomeruli normali31. Inoltre, il laboratorio Hickey ha utilizzato il modello UUO di 12 settimane per studiare le reazioni immunitarie nei glomeruli dei topi. Non hanno trovato differenze nell’infiltrazione di neutrofili tra glomeruli di topo di quattro settimane e glomeruli post-distruttivi32,33. Questi studi successivi sono stati condotti dopo che il bacino del rene ostruito è stato drenato dall’urina. Non lo abbiamo fatto perché volevamo determinare l’effetto di UUO sulla funzione glomerulare come sarebbe in vivo, senza rimuovere artificialmente il fluido che causa l’ostruzione. Infine, l’uso di UUO nei topi viene sostituito dall’imaging dei glomeruli a più di 100 μm sotto la superficie. Sebbene possibile, c’è un compromesso tra risoluzione e intensità, entrambe ridotte significativamente quando si va oltre 50 μm34.

I risultati presentati non sono sorprendenti se si mettono insieme i dati della letteratura esistente sui cambiamenti istologici, la formazione di glomeruli atubulari, l’infiammazione, la fibrosi, l’emodinamica10,11,12. I dati presentati, tra cui l’adesione al WBC, le formazioni di rouleaux, i marcatori di infiammazione molecolare glomerulare e l’aumentata permeabilità all’albumina, indicano ulteriormente l’estesa infiammazione che è in corso in questo modello UUO anche a cinque settimane e presente anche a dodici settimane. Chiaramente, l’UUO cronica non è uno stato fisiologico e l’uso di UUO per indurre glomeruli superficiali rappresenta un modello di lesione. I ratti MWF, che hanno glomeruli superficiali in condizioni fisiologiche, possono essere studiati longitudinalmente quando si verifica una lesione. È possibile generare ratti transgenici e numerosi ricercatori li stanno creando con biosensori per porre domande specifiche. In particolare, il Medical College of Wisconsin ha ora una colonia di ratti MWF e ha realizzato ratti transgenici allo scopo di studiare i processi glomerulari in condizioni fisiologiche e patologiche. Questi ratti MWF offrono una grande opportunità per studiare i processi glomerulari in ratti normali, malati e geneticamente modificati.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases Grants RO1DK091623 e P30DK079312 (a B.A.M.). Ringraziamo il personale della Genomics Core Facility della Research Technology Support Facility (RTSF) della Michigan State University per aver eseguito l’analisi delle nanostringhe.

Materials

70 µm sterile cell strainer Corning #421751
100 µm sterile cell strainer Corning #421752
CA Micro scissors Model 1C300 Electron Microscopy Sciences Cat# 72930
Electric heating pad Sunbeam Kroger
Handling Forceps Electron Microscopy Sciences Cat# 72962
Kelly Hemostatic Forceps (straight) Electron Microscopy Sciences Cat#72930
Leica Dive SP-8 Multi-Photon Inverted Microscope Leica Microsystems Note: Version 7.1r1
MaiTai DeepSee titanium-sapphire laser Spectra-Physics NA
Mayo Dissecting Scissors Electron Microscopy Sciences Cat# 78180-1C3
Metamorph Image processing Software Molecular Dynamics Cat# 78266-04
Microsoft Excel Microsoft Corportation 2007 version
Quant-iT RNA Assay Kit Invitrogen/ThermoFisher Q33140
Reptitherm Undertank Heater Zoomed Amazon
RNeasy MinElute Cleanup Kit (Spin columns) Qiagen 74204
RPE buffer Qiagen 1018013
Strate-Line Autoclave Tape Fisher Scientific Cat# 11-889-1
TRI Reagent Sigma T9424
Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip) Electron Microscopy Sciences Cat# 70665-07
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References

  1. Dunn, K. W., Molitoris, B. A., Dagher, P. C. The Indiana O’Brien center for advanced renal microscopic analysis. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 320 (5), 671-682 (2021).
  2. Dunn, K. W., et al. Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 283 (3), 905-916 (2002).
  3. Eisenbach, G., Liew, J., Boylan, J., Manz, N., Muir, P. Effect of angiotensin on the filtration of protein in the rat kidney: a micropuncture study. Kidney International. 8 (2), 80-87 (1975).
  4. Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Intravital multiphoton microscopy as a tool for studying renal physiology and pathophysiology. Methods. 128, 20-32 (2017).
  5. Sandoval, R. M., Molitoris, B. A., Palygin, O. Fluorescent imaging and microscopy for dynamic processes in rats. Methods in Molecular Biology. 2018, 151-175 (2019).
  6. Huber, T., et al. Molecular basis of the functional podocin-nephrin complex: mutations in the NPHS2 gene disrupt nephrin targeting to lipid raft microdomains. Human Molecular Genetics. 12 (24), 3397-3405 (2003).
  7. Kawachi, H., Koike, H., Kurihara, H., Sakai, T., Shimizu, F. Cloning of rat homologue of podocin: expression in proteinuric states and in developing glomeruli. Journal of the American Society of Nephrology JASN. 14 (1), 46-56 (2003).
  8. Roselli, S., et al. Early glomerular filtration defect and severe renal disease in podocin-deficient mice. Molecular and Cellular Biology. 24 (2), 550-560 (2004).
  9. Schießl, I., Bardehle, S., Castrop, H. Superficial nephrons in BALB/c and C57BL/6 mice facilitate in vivo multiphoton microscopy of the kidney. PloS One. 8 (1), 52499 (2013).
  10. Chevalier, R., Forbes, M., Thornhill, B. Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).
  11. Forbes, M., Thornhill, B., Chevalier, R. Proximal tubular injury and rapid formation of atubular glomeruli in mice with unilateral ureteral obstruction: a new look at an old model. American Journal of Physiology. Renal physiology. 301 (1), 110-117 (2011).
  12. Yang, H. -. C., Zuo, Y., Fogo, A. B. Models of chronic kidney disease. Drug Discovery Today. Disease Models. 7 (1-2), 13-19 (2010).
  13. Hackl, M. J., et al. Tracking the fate of glomerular epithelial cells in vivo using serial multiphoton imaging in new mouse models with fluorescent lineage tags. Nature Medicine. 19 (12), 1661-1666 (2013).
  14. Kitching, A., Kuligowski, M., Hickey, M. In vivo imaging of leukocyte recruitment to glomeruli in mice using intravital microscopy. Methods in Molecular Biology. 466, 109-117 (2009).
  15. Savin, V. J., Terreros, D. A. Filtration in single isolated mammalian glomeruli. Kidney International. 20 (2), 188-197 (1981).
  16. Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nature Protocols. 1 (2), 581-585 (2006).
  17. El Karoui, K., et al. Endoplasmic reticulum stress drives proteinuria-induced kidney lesions via Lipocalin 2. Nature Communications. 7, 10330 (2016).
  18. VA, M., et al. Multiplexed measurements of gene signatures in different analytes using the Nanostring nCounter Assay System. BMC Research Notes. 2, 80 (2009).
  19. Springer, A., et al. A combined transcriptome and bioinformatics approach to unilateral ureteral obstructive uropathy in the fetal sheep model. The Journal of Urology. 187 (2), 751-756 (2012).
  20. Braun, F., Becker, J., Brinkkoetter, P. Live or let die: Is there any cell death in podocytes. Seminars in Nephrology. 36 (3), 208-219 (2016).
  21. Kim, W. The role of angiopoietin-1 in kidney disease. Electrolyte & Blood Pressure E & BP. 6 (1), 22-26 (2008).
  22. Liu, F., Zhuang, S. Role of receptor tyrosine kinase signaling in renal fibrosis. International Journal of Molecular Sciences. 17 (5), 972 (2016).
  23. Martini, S., et al. Integrative biology identifies shared transcriptional networks in CKD. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 25 (11), 2559-2572 (2014).
  24. Mühlberger, I., et al. Integrative bioinformatics analysis of proteins associated with the cardiorenal syndrome. International Journal of Nephrology. 2011, 809378 (2010).
  25. Satirapoj, B., et al. Periostin: novel tissue and urinary biomarker of progressive renal injury induces a coordinated mesenchymal phenotype in tubular cells. Nephrology, Dialysis, Transplantation. 27 (7), 2702-2711 (2012).
  26. Fengxin, Z., et al. Numb contributes to renal fibrosis by promoting tubular epithelial cell cycle arrest at G2/M. Oncotarget. 7 (18), 25604-25619 (2016).
  27. Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Quantifying glomerular permeability of fluorescent macromolecules using 2-photon microscopy in Munich Wistar rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (74), e50052 (2013).
  28. Russo, L. M., et al. Impaired tubular uptake explains albuminuria in early diabetic nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (3), 489-494 (2009).
  29. Russo, L. M., et al. The normal kidney filters nephrotic levels of albumin retrieved by proximal tubule cells: retrieval is disrupted in nephrotic states. Kidney International. 71 (6), 504-513 (2007).
  30. Sandoval, R. M., Wang, E., Molitoris, B. A. Finding the bottom and using it: Offsets and sensitivity in the detection of low intensity values in vivo with 2-photon microscopy. Intravital. 2 (1), 23674 (2014).
  31. Kuligowski, M. P., Kitching, A. R., Hickey, M. J. Leukocyte recruitment to the inflamed glomerulus: a critical role for platelet-derived P-selectin in the absence of rolling. Journal of Immunology. 176 (11), 6991-6999 (2006).
  32. Devi, S., et al. Multiphoton imaging reveals a new leukocyte recruitment paradigm in the glomerulus. Nature Medicine. 19 (1), 107-112 (2013).
  33. Finsterbusch, M., et al. Patrolling monocytes promote intravascular neutrophil activation and glomerular injury in the acutely inflamed glomerulus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (35), 5172-5181 (2016).
  34. Shroff, U. N., Gyarmati, G., Izuhara, A., Deepak, S., Peti-Peterdi, J. A new view of macula densa cell protein synthesis. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 321 (6), 689-704 (2021).

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Wagner, M. C., Sandoval, R. M., Campos-Bilderback, S. B., Molitoris, B. A. Using 2-Photon Microscopy to Quantify the Effects of Chronic Unilateral Ureteral Obstruction on Glomerular Processes. J. Vis. Exp. (181), e63329, doi:10.3791/63329 (2022).
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