Здесь мы представляем протокол с использованием 2-фотонной микроскопии у мюнхенских крыс Wistar Fromter с поверхностными клубочками для количественной оценки влияния длительной обструкции мочеточника на клубочковую динамику и функцию.
Применение новых методов микроскопии к подходящим моделям болезней животных для изучения динамической физиологии почек остается проблемой. Крысы с поверхностными клубочками предоставляют уникальную возможность исследовать физиологические и патофизиологические процессы с помощью прижизненной 2-фотонной микроскопии. Количественная оценка клубочкового капиллярного кровотока и вазоконстрикции и дилатации в ответ на лекарства, проницаемость и воспаление — это лишь некоторые из процессов, которые можно изучить. Кроме того, трансгенные крысы, то есть подоциты, помеченные флуоресцентными красителями и другими подходами к молекулярным биомаркерам, обеспечивают повышенную разрешающую способность для непосредственного мониторинга и количественной оценки белково-белковых взаимодействий и эффектов конкретных молекулярных изменений.
У мышей, у которых отсутствуют поверхностные клубочки после четырехнедельного возраста, односторонняя мочеточниковая обструкция (UUO) в течение нескольких недель использовалась для индуцирования поверхностных клубочков. Поскольку эта индукционная модель не позволяет проводить базовые исследования, мы количественно оценили влияние UUO на клубочковые процессы в модели UUO у мюнхенских крыс Wistar Frömter (MWF), которые имеют поверхностные клубочки в физиологических условиях. Модель UUO в течение пяти недель или более вызывала значительные изменения в грубой морфологии почек, перитубулярном и клубочковом микроциркуляторном русле, а также структуре и функции канальцевого эпителия. Поток клубочковых и перитубулярных эритроцитов (эритроцитов) значительно снизился (р< 0,01), вероятно, из-за значительного увеличения приверженности лейкоцитов (ЛЕЙК) в клубочковых и перитубулярных капиллярах. Коэффициент клубочкового просеивания альбумина увеличился с 0,015 ± 0,002 у необработанных MWF до 0,045 ± 0,05 у 5-недельных крыс UUO MWF. Двенадцать недель UUO привели к дальнейшему увеличению поверхностной клубочковой плотности и коэффициента клубочкового просеивания (GSC) для альбумина. Флуоресцентный альбумин, отфильтрованный через клубочки, не реабсорбировался проксимальными канальцами. Эти данные свидетельствуют о том, что использование UUO для индуцирования поверхностных клубочков ограничивает способность изучать и интерпретировать нормальные клубочковые процессы и изменения заболевания.
Понимание клубочковых процессов, особенно биологии подоцитов, было целью на протяжении более 50 лет. Мюнхенские крысы Wistar с поверхностными клубочками сыграли центральную роль в этих исследованиях, включая исследования микропунктуры, чтобы понять многочисленные аспекты физиологических и патологических процессов 1,2,3. Использование микроскопии для изучения клубочковых компонентов прижизненно было ограничено из-за эффектов фототоксичности до появления 2-фотонной микроскопии, которая минимизировала это токсическое воздействие и увеличила глубину проникновения 1,2. Наряду с быстрым прогрессом в компьютерном оборудовании и программном обеспечении, это позволило проводить трехмерные (3D) и четырехмерные (время) исследования в течение нескольких часов в одной обстановке 1,4,5.
Количественная оценка клубочкового капиллярного кровотока, вазоконстрикции и дилатации в ответ на лекарства, проницаемость и влияние заряда на проницаемость и воспаление – это лишь некоторые из клубочковых процессов, которые были изучены. Кроме того, сегмент S1 проксимального канальца идентифицируется, а различия в поведении трубчатого эпителия S1 и S2 могут быть количественно определены 1,4. Исследования на мышах, особенно с повсеместной доступностью мышиных трансгенных средств, привели к быстрому прогрессу в понимании молекулярной биологии процессов клубочковых заболеваний. Отдельные белки отвечают за клубочковую дисфункцию в нокаут-исследованиях, особенно в отношении протеинурии 6,7,8. Тем не менее, использование мышиных моделей для исследований клубочковой визуализации было ограничено, поскольку клубочки находятся более чем на 100 мкм ниже поверхности в многочисленных изученных штаммах9.
Это привело исследователей к разработке и использованию мышиных моделей, приводящих к поверхностным клубочкам, которые можно изучать. Наиболее распространенной моделью является использование полного UUO 10,11,12. В конце расширенного периода UUO в почках мышей появляются многочисленные поверхностные клубочки, которые могут быть и были изучены13,14. В этих исследованиях на мышах не было базового или контрольного исследования для определения влияния длительного UUO на клубочковую биологию. Поскольку это тяжелая и длительная модель повреждения, приводящая к быстрому фиброзу и разрушению коры 10,11,12, мы предположили, что это повлияет на клубочковые процессы и функцию. Чтобы ответить на этот вопрос, мюнхенские крысы Wistar Fromter (MWF) с поверхностными клубочками были использованы для изучения контрольных / исходных параметров, а исходный результат сравнивали с клубочковыми исследованиями на крысах MWF после пяти недель UUO. Мы также изучили крыс Sprague Dawley (SD), у которых нет поверхностных клубочков после UUO. Полученные данные показывают, что 5 недель UUO у крыс MWF и SD действительно увеличивают количество поверхностных клубочков. Однако это были аномальные клубочки с выраженными изменениями клубочкового кровотока, воспалением, проницаемостью и размером макромолекул.
Изучение клубочковой физиологии видело много различных подходов, в первую очередь использование микропунктуры, перфузии изолированных клубочков и микроскопии. Наличие поверхностных клубочков у мюнхенских крыс Wistar, штаммов Фромтера и Симонсена позволило проводить динамические исследования in vivo . Одним из важных замечаний для исследователей, применяющих эту технологию, является необходимость установки параметров сбора для поддержания последовательных изображений между исследованиями, поэтому автофлуоресценция в ткани остается последовательной. Использование двухпроходного флуоресцеинового / родаминового эпифлуоресцентного куба и настройка параметров усиления на зеленый и красный каналы излучения для имитации на экране компьютера того, что видно через окуляры, обеспечит постоянную цветовую сигнатуру в автофлуоресценции даже между различными системами микроскопов.
Штамм Фромтера широко использовался, поскольку он имеет уменьшенное количество общих клубочков, ~ 75% нормальных, и у мужчин спонтанно развивается гипертония в возрасте около 12 недель, с прогрессирующей протеинурией и последующим фокальным клубочковым склерозом, в конечном итоге умирающим от почечной недостаточности12. Использование этих крыс и добавление 2-фотонной микроскопии с ее уменьшенной фототоксичностью, улучшенной глубиной проникновения и возможностью одновременного просмотра нескольких флуоресцентных зондов проложили путь к новым открытиям 1,4,5. С развитием компьютерного оборудования и программного обеспечения количественные данные теперь являются стандартом для всех 2-фотонных лабораторий. Разработаны и применены многочисленные количественные методы к клубочковым, проксимальным канальцам, сосудистым и интерстициальным процессам в физиологических и болезненных условиях 1,4,5,27,28,29,30.
Трансгенные мышиные генерирующие средства добавили новое измерение к изучению физиологии и патологии почек, и это был только вопрос времени, когда это было объединено с 2-фотонной микроскопией, чтобы еще больше очертить важность конкретных генных продуктов в структуре и функции почек. Однако мышиные клубочки, за исключением очень молодых мышей, расположены на расстоянии более 100 мкм от поверхности почки9. Двухфотонную микроскопию лучше всего проводить на глубине от 20 до 50 мкм в качестве разрешения, и интенсивность флуоресценции быстро уменьшается после этого из-за рассеяния света излучаемого света и поглощения от взаимодействия с гемоглобином. Поэтому необходимо было индуцировать поверхностные клубочки. Обычно используется подход, представляющий собой длительную одностороннюю модель обструкции в течение 12 недель. Поскольку эти модели не позволяют определить исходные условия, отделение эффектов UUO от изучаемого процесса невозможно.
Используя крыс MWF, можно сравнить базовую клубочковую функцию с следующей UUO. Эта модель UUO, как известно, вызывает воспаление и быструю скорость фиброза и использовалась для изучения ХБП и фиброза 10,11,12. Как и ожидалось, наблюдалось увеличение поверхностных клубочков как у MWF, так и у крыс SD. Более того, количественные результаты, полученные после UUO для крыс MWF и SD, были очень сопоставимы. Ранее сообщалось о снижении кровотока, зарегистрированном здесь, при сравнении микроскопических данных после UUO с данными микропунктуры3. Также было хорошо известно, что канальцевая и интерстициальная гистология заметно изменена, а ПТ в основном нефункциональны, как сообщается здесь, с отсутствием эндоцитоза альбумина. Исследования на рисунках 2 и 3 показывают резкое снижение скорости потока эритроцитов в клубочковых и перитубулярных капиллярах и усиление адгезии лейкоцитов. Снижение потока, вероятно, связано с закупоркой капилляров от адгезии WBC и образований руло.
Чтобы дополнительно оценить воспаление, мы количественно оценили проницаемость альбумина и показали, что она увеличивается в десять раз. Кроме того, изолированные клубочки показали, что экспрессия мРНК увеличилась для многих генов, которые, как ранее сообщалось, были увеличены при воспалении почек в различных состояниях заболевания почек 17,19,20,21,22,23,24,25,26 . Увеличение клубочковой поверхностной плотности и проницаемости альбумина было прогрессирующим, как показали 12-недельные данные UUO. Представленные данные являются первыми, которые непосредственно показывают, что клубочки подвергаются значительным структурным повреждениям, воспалению и молекулярным изменениям в модели UUO. Результаты согласуются с более ранним исследованием целой почечной ткани, в котором анализировались биопсии почек овец после UUO, обнаружив, что множественные маркеры воспаления повышенына 19. Настоящие результаты показывают, что в клубочках существует выраженное воспаление, ранее известное только для кортикальной ткани.
Настоящие данные отличаются от более ранних исследований на мышах, где не было обнаружено никаких изменений в экспрессии молекул адгезии, отложении комплемента и инфильтрации нейтрофилов между 12-недельными постгидронефротическими и нормальными клубочками31. Кроме того, лаборатория Хикки использовала 12-недельную модель UUO для изучения иммунных реакций у клубочков мышей. Они не обнаружили различий в инфильтрации нейтрофилов между четырехнедельными клубочками мыши и постобструктивными клубочками32,33. Эти более поздние исследования были проведены после того, как таз закупоренной почки был выведен из мочи. Мы этого не сделали, так как хотели определить влияние UUO на клубочковую функцию, как это было бы in vivo, без искусственного удаления жидкости, вызывающей обструкцию. Наконец, использование UUO у мышей заменяется визуализацией клубочков на глубине более 100 мкм под поверхностью. Хотя это возможно, существует компромисс в разрешении и интенсивности, которые значительно снижаются по мере того, как один из них выходит за пределы 50 мкм34.
Представленные результаты не удивительны, если собрать воедино данные из существующей литературы по гистологическим изменениям, образованию клубочков, воспалению, фиброзу, гемодинамике 10,11,12. Представленные данные, включая адгезию WBC, образования руло, клубочковые молекулярные маркеры воспаления и повышенную проницаемость альбумина, дополнительно указывают на обширное воспаление, которое продолжается в этой модели UUO даже через пять недель, а также присутствует через двенадцать недель. Очевидно, что хронический UUO не является физиологическим состоянием, и использование UUO для индуцирования поверхностных клубочков представляет собой модель травмы. Крысы MWF, которые имеют поверхностные клубочки в физиологических условиях, могут быть продольно изучены по мере получения травмы. Можно генерировать трансгенных крыс, и многочисленные исследователи создают их с помощью биосенсоров, чтобы задавать конкретные вопросы. В частности, Медицинский колледж Висконсина теперь имеет колонию крыс MWF и сделал трансгенных крыс с целью изучения клубочковых процессов в физиологических и патологических условиях. Эти крысы MWF предлагают прекрасную возможность для изучения клубочковых процессов у нормальных, больных и генетически измененных крыс.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана грантами Национального института диабета и заболеваний пищеварительной системы и почек RO1DK091623 и P30DK079312 (до B.A.M.). Мы благодарим сотрудников Genomics Core Facility Центра поддержки исследовательских технологий (RTSF) в Университете штата Мичиган за проведение анализа Nanostring.
70 µm sterile cell strainer | Corning | #421751 | |
100 µm sterile cell strainer | Corning | #421752 | |
CA Micro scissors Model 1C300 | Electron Microscopy Sciences | Cat# 72930 | |
Electric heating pad | Sunbeam | Kroger | |
Handling Forceps | Electron Microscopy Sciences | Cat# 72962 | |
Kelly Hemostatic Forceps (straight) | Electron Microscopy Sciences | Cat#72930 | |
Leica Dive SP-8 Multi-Photon Inverted Microscope | Leica Microsystems | Note: Version 7.1r1 | |
MaiTai DeepSee titanium-sapphire laser | Spectra-Physics | NA | |
Mayo Dissecting Scissors | Electron Microscopy Sciences | Cat# 78180-1C3 | |
Metamorph Image processing Software | Molecular Dynamics | Cat# 78266-04 | |
Microsoft Excel | Microsoft Corportation | 2007 version | |
Quant-iT RNA Assay Kit | Invitrogen/ThermoFisher | Q33140 | |
Reptitherm Undertank Heater | Zoomed | Amazon | |
RNeasy MinElute Cleanup Kit (Spin columns) | Qiagen | 74204 | |
RPE buffer | Qiagen | 1018013 | |
Strate-Line Autoclave Tape | Fisher Scientific | Cat# 11-889-1 | |
TRI Reagent | Sigma | T9424 | |
Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip) | Electron Microscopy Sciences | Cat# 70665-07 |