Hier presenteren we een protocol met behulp van 2-fotonmicroscopie in München Wistar Fromter-ratten met oppervlakteglomeruli om de effecten van langdurige ureterale obstructie op glomerulaire dynamiek en functie te kwantificeren.
Het toepassen van nieuwe microscopiemethoden op geschikte dierziektemodellen om de dynamische fysiologie van de nier te verkennen, blijft een uitdaging. Ratten met oppervlakteglomeruli bieden een unieke kans om fysiologische en pathofysiologische processen te onderzoeken met behulp van intravitale 2-fotonenmicroscopie. Kwantificering van glomerulaire capillaire bloedstroom en vasoconstrictie en dilatatie als reactie op geneesmiddelen, permeabiliteit en ontsteking zijn slechts enkele van de processen die kunnen worden bestudeerd. Bovendien bieden transgene ratten, d.w.z. podocyten gelabeld met fluorescerende kleurstoffen en andere moleculaire biomarkerbenaderingen, een verhoogde resolutie om eiwit-eiwitinteracties en de effecten van specifieke moleculaire veranderingen direct te monitoren en te kwantificeren.
Bij muizen, die na vier weken geen oppervlakteglomeruli meer hebben, is unilaterale ureterale obstructie (UUO) gedurende enkele weken gebruikt om oppervlakteglomeruli te induceren. Omdat dit inductiemodel geen basisstudies mogelijk maakt, hebben we de effecten van UUO op glomerulaire processen gekwantificeerd in het UUO-model in München Wistar Frömter (MWF) ratten, die onder fysiologische omstandigheden oppervlakteglomeruli hebben. Het UUO-model gedurende vijf weken of langer veroorzaakte significante veranderingen in de bruto renale morfologie, de peritubulaire en glomerulaire microvasculatuur, evenals de structuur en functie van tubulaire epithelia. De stroom van glomerulaire en peritubulaire rode bloedcellen (RBC) nam significant af (p < 0,01), waarschijnlijk als gevolg van de significante toename van de hechting van witte bloedcellen (WBC's) in glomerulaire en peritubulaire haarvaten. De glomerulaire zeefcoëfficiënt van albumine steeg van 0,015 ± 0,002 in onbehandelde MWF's tot 0,045 ± 0,05 bij 5 weken oude UUO MWF-ratten. Twaalf weken UUO resulteerden in verdere toename van de glomerulaire oppervlaktedichtheid en glomerulaire zeefcoëfficiënt (GSC) voor albumine. Fluorescerend albumine gefilterd over de glomeruli werd niet opnieuw geabsorbeerd door de proximale tubuli. Deze gegevens suggereren dat het gebruik van UUO om oppervlakteglomeruli te induceren het vermogen beperkt om normale glomerulaire processen en ziekteveranderingen te bestuderen en te interpreteren.
Het begrijpen van glomerulaire processen, met name podocytenbiologie, is al meer dan 50 jaar een doel. München Wistar-ratten met oppervlakteglomeruli hebben een centrale rol gespeeld in deze studies, waaronder micropunctuurstudies, om tal van aspecten van fysiologische en pathologische processen te begrijpen 1,2,3. Het gebruik van microscopie om glomerulaire componenten intravitaal te bestuderen was beperkt vanwege de effecten van fototoxiciteit tot de komst van 2-fotonmicroscopie die deze toxische blootstelling minimaliseerde en de penetratiediepte verhoogde 1,2. Samen met de snelle vooruitgang in computerhardware en -software, heeft dit het mogelijk gemaakt om urenlang driedimensionale (3D) en vierdimensionale (tijd) studies te doen in een enkele instelling 1,4,5.
De kwantificering van glomerulaire capillaire bloedstroom, vasoconstrictie en dilatatie als reactie op geneesmiddelen, permeabiliteit en de effecten van lading op permeabiliteit en ontsteking zijn slechts enkele van de glomerulaire processen die zijn bestudeerd. Bovendien is het S1-segment van de proximale tubulus identificeerbaar en kunnen de verschillen in het gedrag van S1- en S2-tubulair epitheel worden gekwantificeerd 1,4. Studies bij muizen, vooral met de universele beschikbaarheid van muistransgene faciliteiten, hebben geleid tot snelle vooruitgang in het begrip van de moleculaire biologie van glomerulaire ziekteprocessen. Individuele eiwitten zijn verantwoordelijk voor glomerulaire disfunctie in knock-outstudies, vooral met betrekking tot proteïnurie 6,7,8. Het gebruik van muismodellen voor glomerulaire beeldvormingsstudies is echter beperkt omdat glomeruli zich meer dan 100 μm onder het oppervlak bevinden in de talrijke bestudeerde stammen9.
Dit heeft ertoe geleid dat onderzoekers muismodellen hebben ontwikkeld en gebruikt die resulteren in oppervlakteglomeruli die kunnen worden bestudeerd. Het meest voorkomende model is het gebruik van complete UUO 10,11,12. Aan het einde van de verlengde UUO-periode zijn er tal van oppervlakteglomeruli in muizennieren die13,14 kunnen en zijn onderzocht. Er is geen baseline- of controlestudie geweest in deze muisstudies om de effecten van langdurige UUO op glomerulaire biologie te bepalen. Omdat dit een ernstig en langdurig model van letsel is dat resulteert in snelle fibrose en corticale vernietiging 10,11,12, veronderstelden we dat er effecten zouden zijn op glomerulaire processen en functie. Om deze vraag te beantwoorden, werden Munich Wistar Fromter (MWF) ratten met oppervlakteglomeruli gebruikt om controle / baselineparameters te bestuderen, en de baselinebevinding werd vergeleken met glomerulaire studies bij MWF-ratten na vijf weken UUO. We bestudeerden ook Sprague Dawley (SD) ratten die geen oppervlakteglomeruli hebben na UUO. De bevindingen geven aan dat 5 weken UUO bij MWF- en SD-ratten inderdaad het aantal oppervlakteglomeruli verhogen. Dit waren echter abnormale glomeruli met duidelijke veranderingen in de glomerulaire bloedstroom, ontsteking en macromolecuuldoorlaatbaarheid en -grootte.
De studie van glomerulaire fysiologie heeft veel verschillende benaderingen gezien, met name het gebruik van micropunctuur, perfusie van geïsoleerde glomeruli en microscopie. De beschikbaarheid van oppervlakteglomeruli in München Wistar-ratten, Fromter- en Simonsen-stammen heeft in vivo dynamische studies mogelijk gemaakt. Een belangrijke opmerking voor onderzoekers die deze technologie gebruiken, is de noodzaak om acquisitieparameters in te stellen om consistente beelden tussen studies te behouden, zodat de autofluorescentie in weefsel consistent blijft. Het gebruik van een dual-pass fluoresceïne / rhodamine epifluorescentiekubus en het aanpassen van de versterkingsinstellingen aan de groene en rode emissiekanalen om op het computerscherm na te bootsen wat door de oculairs wordt gezien, zorgt voor een consistente kleursignatuur in de autofluorescentie, zelfs tussen verschillende microscoopsystemen.
De Fromter-stam is op grote schaal gebruikt omdat het een verminderd aantal totale glomeruli heeft, ~ 75% normaal, en de mannen ontwikkelen spontaan hypertensie rond de leeftijd van 12 weken, met progressieve proteïnurie en daaropvolgende focale glomerulaire sclerose, uiteindelijk stervend aan nierfalen12. Het gebruik van deze ratten en de toevoeging van 2-fotonmicroscopie met zijn verminderde fototoxiciteit, verbeterde penetratiediepte en de mogelijkheid om meerdere fluorescerende sondes tegelijkertijd te bekijken, maakten de weg vrij voor nieuwe ontdekkingen 1,4,5. Met de ontwikkeling van computerhardware en -software zijn kwantitatieve gegevens nu de standaard voor alle 2-fotonlaboratoria. Meerdere kwantitatieve technieken zijn ontwikkeld en toegepast op glomerulaire, proximale tubuli, vasculaire en interstitiële processen onder fysiologische en ziekteomstandigheden 1,4,5,27,28,29,30.
Transgene muisgeneratiefaciliteiten voegden een nieuwe dimensie toe aan de studie van nierfysiologie en pathologie, en het was slechts een kwestie van tijd totdat dit werd gecombineerd met 2-fotonmicroscopie om het belang van specifieke genproducten in de nierstructuur en -functie verder af te bakenen. Muisglomeruli, behalve bij zeer jonge muizen, bevinden zich echter op meer dan 100 μm van het oppervlak van de nier9. Twee-fotonenmicroscopie kan het beste worden uitgevoerd op een diepte tussen 20 en 50 μm als resolutie, en de fluorescentie-intensiteit neemt daarna snel af als gevolg van lichtverstrooiing van uitgezonden licht en absorptie door interactie met hemoglobine. Daarom was het noodzakelijk om oppervlakteglomeruli te induceren. De meest gebruikte aanpak is een langdurig eenzijdig obstructiemodel gedurende 12 weken. Omdat deze modellen geen basislijnbepalingen mogelijk maken, is het niet mogelijk om de effecten van de UUO te scheiden van het proces dat wordt bestudeerd.
Met behulp van MWF-ratten kan men de glomerulaire functie vergelijken met die na UUO. Van dit UUO-model is bekend dat het ontstekingen en een snelle snelheid van fibrose induceert en is gebruikt om CKD en fibrose 10,11,12 te bestuderen. Zoals verwacht was er een toename van oppervlakteglomeruli bij zowel de MWF- als sd-ratten. Bovendien waren de kwantitatieve resultaten na de UUO voor de MWF- en SD-ratten zeer vergelijkbaar. De hier geregistreerde vermindering van de bloedstroom was eerder gemeld door microscopische gegevens na UUO te vergelijken met micropunctuurgegevens3. Het was ook bekend dat tubulaire en interstitiële histologie duidelijk is veranderd, en de PT’s zijn meestal niet-functioneel, zoals hier gemeld, met een gebrek aan albumine-endocytose. De studies in figuur 2 en figuur 3 tonen een dramatische vermindering van de RBC-stroomsnelheid in glomerulaire en peritubulaire capillairen en verbeterde WBC-adhesie. De vermindering van de stroming is waarschijnlijk te wijten aan capillaire blokkade van WBC-adhesie en rouleauxformaties.
Om ontstekingen verder te evalueren, kwantificeerden we de albuminedoorlaatbaarheid en toonden we aan dat deze vertienvoudigde. Bovendien toonde geïsoleerde glomeruli aan dat de mRNA-expressie toenam voor veel genen waarvan eerder bekend was dat ze verhoogd waren bij nierontsteking in een verscheidenheid aan nierziektetoestanden 17,19,20,21,22,23,24,25,26 . De toename van de glomerulaire oppervlaktedichtheid en albuminedoorlaatbaarheid waren progressief, zoals blijkt uit de 12-weekse UUO-gegevens. De huidige gegevens zijn de eerste die direct aantonen dat glomeruli aanzienlijke structurele schade, ontstekingen en moleculaire veranderingen ondergaan in het UUO-model. De resultaten komen overeen met een eerdere studie van volledig nierweefsel dat schapennierbiopten na UUO analyseerde en meerdere ontstekingsmarkers vond die19 verhoogden. De huidige resultaten wijzen erop dat er een duidelijke ontsteking bestaat in de glomeruli, voorheen alleen bekend om corticale weefsel.
De huidige gegevens verschillen van eerdere studies bij muizen waar geen veranderingen werden gevonden in adhesiemolecuulexpressie, complementafzetting en neutrofiele infiltratie tussen 12 weken posthydronefrrotische en normale glomeruli31. Daarnaast gebruikte het Hickey-laboratorium het 12 weken durende UUO-model om immuunreacties in glomeruli van muizen te bestuderen. Ze vonden geen verschillen in neutrofiele infiltratie tussen vier weken oude muisglomeruli en postobstructieve glomeruli32,33. Deze latere studies werden uitgevoerd nadat het bekken van de geblokkeerde nier was afgevoerd van urine. We hebben dit niet gedaan omdat we het effect van UUO op de glomerulaire functie wilden bepalen zoals het in vivo zou zijn, zonder kunstmatig de vloeistof te verwijderen die de obstructie veroorzaakt. Tot slot wordt het gebruik van UUO bij muizen vervangen door het in beeld brengen van glomeruli op meer dan 100 μm onder het oppervlak. Hoewel mogelijk, is er een afweging in resolutie en intensiteit, die beide aanzienlijk worden verminderd naarmate men verder gaat dan 50 μm34.
De gepresenteerde resultaten zijn niet verrassend als men de gegevens uit de bestaande literatuur over histologische veranderingen, vorming van atubulaire glomeruli, ontsteking, fibrose, hemodynamieksamenvoegt 10,11,12. De gepresenteerde gegevens, waaronder WBC-adhesie, rouleauxformaties, glomerulaire moleculaire ontstekingsmarkers en verhoogde albuminedoorlaatbaarheid, wijzen verder op de uitgebreide ontsteking die in dit UUO-model aan de gang is, zelfs na vijf weken en ook aanwezig is na twaalf weken. Het is duidelijk dat chronische UUO geen fysiologische toestand is en het gebruik van UUO om oppervlakteglomeruli te induceren vertegenwoordigt een verwondingsmodel. De MWF-ratten, die onder fysiologische omstandigheden oppervlakteglomeruli hebben, kunnen longitudinaal worden bestudeerd als er letsel optreedt. Het is mogelijk om transgene ratten te genereren en tal van onderzoekers maken ze met biosensoren om specifieke vragen te stellen. In het bijzonder heeft het Medical College of Wisconsin nu een kolonie MWF-ratten en heeft het transgene ratten gemaakt met als doel glomerulaire processen onder fysiologische en pathologische omstandigheden te bestuderen. Deze MWF-ratten bieden een geweldige kans om glomerulaire processen te bestuderen bij normale, zieke en genetisch veranderde ratten.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door het National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases Grants RO1DK091623 en P30DK079312 (aan B.A.M.). We bedanken het personeel van de Genomics Core Facility van de Research Technology Support Facility (RTSF) van de Michigan State University voor het uitvoeren van de Nanostring-analyse.
70 µm sterile cell strainer | Corning | #421751 | |
100 µm sterile cell strainer | Corning | #421752 | |
CA Micro scissors Model 1C300 | Electron Microscopy Sciences | Cat# 72930 | |
Electric heating pad | Sunbeam | Kroger | |
Handling Forceps | Electron Microscopy Sciences | Cat# 72962 | |
Kelly Hemostatic Forceps (straight) | Electron Microscopy Sciences | Cat#72930 | |
Leica Dive SP-8 Multi-Photon Inverted Microscope | Leica Microsystems | Note: Version 7.1r1 | |
MaiTai DeepSee titanium-sapphire laser | Spectra-Physics | NA | |
Mayo Dissecting Scissors | Electron Microscopy Sciences | Cat# 78180-1C3 | |
Metamorph Image processing Software | Molecular Dynamics | Cat# 78266-04 | |
Microsoft Excel | Microsoft Corportation | 2007 version | |
Quant-iT RNA Assay Kit | Invitrogen/ThermoFisher | Q33140 | |
Reptitherm Undertank Heater | Zoomed | Amazon | |
RNeasy MinElute Cleanup Kit (Spin columns) | Qiagen | 74204 | |
RPE buffer | Qiagen | 1018013 | |
Strate-Line Autoclave Tape | Fisher Scientific | Cat# 11-889-1 | |
TRI Reagent | Sigma | T9424 | |
Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip) | Electron Microscopy Sciences | Cat# 70665-07 |