Aqui, apresentamos um protocolo utilizando microscopia de 2 fótons em ratos Wistar Fromter de Munique com glomérulos superficiais para quantificar os efeitos da obstrução ureteral prolongada na dinâmica e função glomerular.
A aplicação de novos métodos de microscopia a modelos adequados de doenças animais para explorar a fisiologia dinâmica do rim continua a ser um desafio. Ratos com glomérulos superficiais oferecem uma oportunidade única para investigar processos fisiológicos e fisiopatológicos usando microscopia intravital de 2 fótons. A quantificação do fluxo sanguíneo capilar glomerular e a vasoconstrição e dilatação em resposta a drogas, permeabilidade e inflamação são apenas alguns dos processos que podem ser estudados. Além disso, ratos transgênicos, ou seja, podócitos marcados com corantes fluorescentes e outras abordagens de biomarcadores moleculares, fornecem maior resolução para monitorar e quantificar diretamente as interações proteína-proteína e os efeitos de alterações moleculares específicas.
Em camundongos, que não possuem glomérulos superficiais após quatro semanas de idade, a obstrução ureteral unilateral (UUO) por várias semanas tem sido usada para induzir glomérulos superficiais. Como este modelo de indução não permite estudos de linha de base, quantificamos os efeitos da UUO em processos glomerulares no modelo UUO em ratos Munich Wistar Frömter (MWF), que apresentam glomérulos superficiais em condições fisiológicas. O modelo UUO por cinco semanas ou mais induziu alterações significativas na morfologia renal macroscópica, na microvasculatura peritubular e glomerular, bem como na estrutura e função do epitélio tubular. O fluxo de hemácias (hemácias) glomerulares e peritubulares diminuiu significativamente (p < 0,01), provavelmente devido ao aumento significativo da aderência de leucócitos (leucócitos) nos capilares glomerular e peritubular. O coeficiente de peneiramento glomerular da albumina aumentou de 0,015 ± 0,002 em MWFs não tratados para 0,045 ± 0,05 em ratos UUO MWF de 5 semanas de idade. Doze semanas de UUO resultaram em novos aumentos na densidade glomerular de superfície e no coeficiente de peneiramento glomerular (GSC) para albumina. A albumina fluorescente filtrada através dos glomérulos não foi reabsorvida pelos túbulos proximais. Esses dados sugerem que o uso de UUO para induzir glomérulos superficiais limita a capacidade de estudar e interpretar processos glomerulares normais e alterações de doenças.
Compreender os processos glomerulares, especialmente a biologia dos podócitos, tem sido um objetivo há mais de 50 anos. Ratos Wistar de Munique com glomérulos de superfície têm desempenhado um papel central nesses estudos, incluindo estudos de micropunção, para compreender inúmeros aspectos dos processos fisiológicos e patológicos 1,2,3. A utilização da microscopia para o estudo intravital dos componentes glomerulares foi limitada devido aos efeitos da fototoxicidade até o advento da microscopia de 2 fótons que minimizou essa exposição tóxica e aumentou a profundidade de penetração 1,2. Juntamente com os rápidos avanços em hardware e software de computador, isso permitiu estudos tridimensionais (3D) e quadridimensionais (tempo) por horas em uma única configuração 1,4,5.
A quantificação do fluxo sanguíneo capilar glomerular, vasoconstrição e dilatação em resposta a drogas, permeabilidade e os efeitos da carga sobre a permeabilidade e inflamação são apenas alguns dos processos glomerulares que têm sido estudados. Além disso, o segmento S1 do túbulo proximal é identificável, e as diferenças no comportamento do epitélio tubular S1 e S2 podem ser quantificadas 1,4. Estudos em camundongos, especialmente com a disponibilidade universal de instalações transgênicas em camundongos, levaram a rápidos avanços na compreensão da biologia molecular dos processos de doenças glomerulares. Proteínas individuais são responsáveis pela disfunção glomerular em estudos knockout, principalmente no que diz respeito à proteinúria 6,7,8. No entanto, a utilização de modelos de camundongos para exames de imagem glomerular tem sido limitada, pois os glomérulos estão mais de 100 μm abaixo da superfície nas numerosas cepasestudadas9.
Isso levou os pesquisadores a desenvolver e utilizar modelos de camundongos, resultando em glomérulos de superfície que podem ser estudados. O modelo mais comum é o uso de UUO completo10,11,12. Ao final do período prolongado de UUO, existem inúmeros glomérulos superficiais em rins de camundongos que podem ser e têm sido estudados13,14. Não houve nenhum estudo de linha de base ou controle nesses estudos em camundongos para determinar os efeitos da UUO prolongada na biologia glomerular. Por se tratar de um modelo grave e prolongado de lesão, resultando em fibrose rápida e destruição cortical10,11,12, levantamos a hipótese de que haveria efeitos sobre os processos e a função glomerular. Para responder a essa pergunta, ratos Munich Wistar Fromter (MWF) com glomérulos superficiais foram usados para estudar parâmetros de controle/basais, e o achado basal foi comparado com estudos glomerulares em ratos MWF após cinco semanas de UUO. Também estudamos ratos Sprague Dawley (SD) que não apresentam glomérulos superficiais após UUO. Os resultados indicam que 5 semanas de UUO em ratos MWF e SD de fato aumentam o número de glomérulos superficiais. No entanto, estes eram glomérulos anormais com alterações acentuadas no fluxo sanguíneo glomerular, inflamação e permeabilidade e tamanho das macromoléculas.
O estudo da fisiologia glomerular tem visto muitas abordagens diferentes, mais notavelmente o uso de micropunção, perfusão de glomérulos isolados e microscopia. A disponibilidade de glomérulos de superfície em ratos Wistar de Munique, cepas Fromter e Simonsen, permitiu estudos dinâmicos in vivo. Uma observação importante para os pesquisadores que adotam essa tecnologia é a necessidade de definir parâmetros de aquisição para manter imagens consistentes entre os estudos, de modo que a autofluorescência no tecido permaneça consistente. Utilizar um cubo de epifluorescência de fluoresceína / rodamina de passagem dupla e ajustar as configurações de ganho aos canais de emissão verde e vermelho para imitar na tela do computador o que é visto através das oculares garantirá uma assinatura de cor consistente na autofluorescência, mesmo entre diferentes sistemas de microscópio.
A cepa de Fromter tem sido amplamente utilizada, pois apresenta um número reduzido de glomérulos totais, ~75% normais, e os homens desenvolvem espontaneamente hipertensão por volta das 12 semanas de idade, com proteinúria progressiva e subsequente esclerose glomerular focal, eventualmente morrendo de insuficiência renal12. O uso desses ratos e a adição da microscopia de 2 fótons com sua fototoxicidade reduzida, maior profundidade de penetração e capacidade de visualizar múltiplas sondas fluorescentes simultaneamente abriram caminho para novas descobertas 1,4,5. Com o desenvolvimento de hardware e software de computador, os dados quantitativos são agora o padrão para todos os laboratórios de 2 fótons. Múltiplas técnicas quantitativas têm sido desenvolvidas e aplicadas aos processos glomerular, túbulo proximal, vascular e intersticial em condições fisiológicas e de doença 1,4,5,27,28,29,30.
As instalações geradoras de camundongos transgênicos adicionaram uma nova dimensão ao estudo da fisiologia e patologia renal, e era apenas uma questão de tempo até que isso fosse combinado com a microscopia de 2 fótons para delinear ainda mais a importância de produtos genéticos específicos na estrutura e função renal. No entanto, os glomérulos de camundongos, exceto em camundongos muito jovens, estão localizados a mais de 100 μm da superfície do rim9. A microscopia de dois fótons é melhor realizada a uma profundidade entre 20 e 50 μm como resolução, e a intensidade da fluorescência diminui rapidamente a partir de então devido ao espalhamento da luz emitida e à absorção da interação com a hemoglobina. Portanto, foi necessário induzir glomérulos superficiais. A abordagem comumente utilizada é um modelo de obstrução unilateral prolongada por 12 semanas. Como esses modelos não permitem determinações de linha de base, a separação dos efeitos da UUO do processo que está sendo estudado não é possível.
Usando ratos MWF, pode-se comparar a função glomerular basal com a seguinte UUO. Sabe-se que esse modelo UUO induz inflamação e uma rápida taxa de fibrose e tem sido utilizado para estudar DRC e fibrose10,11,12. Como esperado, houve um aumento nos glomérulos superficiais em ratos MWF e SD. Além disso, os resultados quantitativos obtidos após a UUO para os ratos MWF e SD foram muito comparáveis. A redução do fluxo sanguíneo aqui registrada havia sido relatada anteriormente comparando dados microscópicos após UUO com dados de micropunção3. Também foi sabido que a histologia tubular e intersticial está marcadamente alterada, e os TPs são, em sua maioria, não funcionais, como aqui relatado, com ausência de endocitose albumina. Os estudos da Figura 2 e da Figura 3 mostram uma redução drástica na taxa de fluxo de hemácias nos capilares glomerular e peritubular e maior adesão aos leucócitos. As reduções no fluxo são provavelmente devidas ao bloqueio capilar da adesão leucocitária e formações de rouleaux.
Para avaliar melhor a inflamação, quantificamos a permeabilidade à albumina e mostramos que ela aumenta dez vezes. Além disso, glomérulos isolados mostraram que a expressão de mRNA aumentou para muitos genes anteriormente conhecidos por estarem aumentados na inflamação renal em uma variedade de estados de doença renal 17,19,20,21,22,23,24,25,26 . Os aumentos na densidade da superfície glomerular e na permeabilidade à albumina foram progressivos, como mostram os dados de UUO de 12 semanas. Os dados atuais são os primeiros a mostrar diretamente que os glomérulos sofrem danos estruturais significativos, inflamação e alterações moleculares no modelo UUO. Os resultados são consistentes com um estudo anterior de tecido renal inteiro que analisou biópsias renais de ovelhas após UUO, encontrando múltiplos marcadores de inflamação elevados19. Os presentes resultados indicam que existe inflamação acentuada dentro dos glomérulos, anteriormente conhecida apenas para o tecido cortical.
Os presentes dados diferem de estudos anteriores em camundongos, onde não foram encontradas alterações na expressão da molécula de adesão, deposição de complemento e infiltração de neutrófilos entre glomérulos pós-hidronefróticos e normais de 12 semanas31. Além disso, o laboratório Hickey usou o modelo UUO de 12 semanas para estudar reações imunes em glomérulos de camundongos. Não encontraram diferenças na infiltração de neutrófilos entre glomérulos de camundongos de quatro semanas de idade e glomérulos pós-obstrutivos32,33. Estes estudos posteriores foram realizados depois que a pelve do rim obstruído foi drenada de urina. Não fizemos isso, pois queríamos determinar o efeito da UUO na função glomerular como seria in vivo, sem remover artificialmente o fluido causador da obstrução. Finalmente, o uso de UUO em camundongos está sendo substituído por glomérulos de imagem a mais de 100 μm abaixo da superfície. Embora possível, há um trade-off de resolução e intensidade, ambos sendo reduzidos significativamente à medida que se vai além de 50 μm34.
Os resultados apresentados não surpreendem se juntarmos os dados da literatura existente sobre alterações histológicas, formação de glomérulos atubulares, inflamação, fibrose, hemodinâmica10,11,12. Os dados apresentados, incluindo adesão leucocitária, formações rouleaux, marcadores de inflamação molecular glomerular e aumento da permeabilidade à albumina, indicam ainda a extensa inflamação que está em curso neste modelo UUO mesmo às cinco semanas e também presente às doze semanas. Claramente, a UUO crônica não é um estado fisiológico, e o uso de UUO para induzir glomérulos superficiais representa um modelo de lesão. Os ratos MWF, que apresentam glomérulos superficiais em condições fisiológicas, podem ser estudados longitudinalmente à medida que a lesão ocorre. É possível gerar ratos transgênicos, e numerosos pesquisadores estão criando-os com biossensores para fazer perguntas específicas. Em particular, a Faculdade de Medicina de Wisconsin agora tem uma colônia de ratos MWF e fez ratos transgênicos com a finalidade de estudar processos glomerulares sob condições fisiológicas e patológicas. Esses ratos MWF oferecem uma grande oportunidade para estudar processos glomerulares em ratos normais, doentes e geneticamente alterados.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais Grants RO1DK091623 e P30DK079312 (para B.A.M.). Agradecemos à equipe do Genomics Core Facility do Research Technology Support Facility (RTSF) da Michigan State University por realizar a análise de nanocordas.
70 µm sterile cell strainer | Corning | #421751 | |
100 µm sterile cell strainer | Corning | #421752 | |
CA Micro scissors Model 1C300 | Electron Microscopy Sciences | Cat# 72930 | |
Electric heating pad | Sunbeam | Kroger | |
Handling Forceps | Electron Microscopy Sciences | Cat# 72962 | |
Kelly Hemostatic Forceps (straight) | Electron Microscopy Sciences | Cat#72930 | |
Leica Dive SP-8 Multi-Photon Inverted Microscope | Leica Microsystems | Note: Version 7.1r1 | |
MaiTai DeepSee titanium-sapphire laser | Spectra-Physics | NA | |
Mayo Dissecting Scissors | Electron Microscopy Sciences | Cat# 78180-1C3 | |
Metamorph Image processing Software | Molecular Dynamics | Cat# 78266-04 | |
Microsoft Excel | Microsoft Corportation | 2007 version | |
Quant-iT RNA Assay Kit | Invitrogen/ThermoFisher | Q33140 | |
Reptitherm Undertank Heater | Zoomed | Amazon | |
RNeasy MinElute Cleanup Kit (Spin columns) | Qiagen | 74204 | |
RPE buffer | Qiagen | 1018013 | |
Strate-Line Autoclave Tape | Fisher Scientific | Cat# 11-889-1 | |
TRI Reagent | Sigma | T9424 | |
Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip) | Electron Microscopy Sciences | Cat# 70665-07 |