Burada, uzun süreli üreter tıkanıklığının glomerüler dinamikler ve fonksiyon üzerindeki etkilerini ölçmek için Münih Wistar Fromter sıçanlarında yüzey glomerüllü 2-foton mikroskobu kullanan bir protokol sunuyoruz.
Böbreğin dinamik fizyolojisini keşfetmek için uygun hayvan hastalığı modellerine yeni mikroskopi yöntemleri uygulamak zor olmaya devam etmektedir. Yüzey glomerüllü sıçanlar, intravital 2-foton mikroskopisi kullanarak fizyolojik ve patofizyolojik süreçleri araştırmak için eşsiz bir fırsat sağlar. Glomerüler kılcal kan akımının nicelleştirilmesi ve ilaçlara, geçirgenliğe ve inflamasyona yanıt olarak vazokonstriksiyon ve dilatasyon, çalışılabilecek süreçlerden sadece birkaçıdır. Ek olarak, transgenik sıçanlar, yani floresan boyalar ve diğer moleküler biyobelirteç yaklaşımları ile etiketlenmiş podositler, protein-protein etkileşimlerini ve spesifik moleküler değişikliklerin etkilerini doğrudan izlemek ve ölçmek için artan çözünürlük sağlar.
Dört haftalıktan sonra yüzey glomerüllerinden yoksun olan farelerde, yüzey glomerüllerini indüklemek için birkaç hafta boyunca tek taraflı üreter tıkanıklığı (UUO) kullanılmıştır. Bu indüksiyon modeli temel çalışmalara izin vermediğinden, fizyolojik koşullar altında yüzey glomerüllerine sahip Münih Wistar Frömter (MWF) sıçanlarındaki UUO modelinde UUO’nun glomerüler süreçler üzerindeki etkilerini ölçtük. Beş hafta veya daha uzun süreli UUO modeli, brüt böbrek morfolojisinde, peritübüler ve glomerüler mikrovaskülatürde ve ayrıca tübüler epitelin yapısında ve fonksiyonunda önemli değişikliklere neden oldu. Glomerüler ve peritübüler kırmızı kan hücresi (RBC) akımı, muhtemelen glomerüler ve peritübüler kılcal damarlar içindeki beyaz kan hücrelerinin (WBC’ler) aderansındaki anlamlı artışa bağlı olarak anlamlı olarak azalmıştır (p < 0.01). Albüminin glomerüler eleme katsayısı, tedavi edilmemiş MWF'lerde 0.015 ± 0.002'den 5 haftalık UUO MWF sıçanlarında 0.045 ± 0.05'e yükselmiştir. On iki haftalık UUO, albümin için yüzey glomerüler yoğunluğunda ve glomerüler eleme katsayısında (GSC) daha fazla artışa neden oldu. Glomerüller boyunca filtrelenen floresan albümin, proksimal tübüller tarafından yeniden emilmedi. Bu veriler, yüzey glomerüllerini indüklemek için UUO kullanmanın normal glomerüler süreçleri ve hastalık değişikliklerini inceleme ve yorumlama yeteneğini sınırladığını göstermektedir.
Glomerüler süreçleri, özellikle podosit biyolojisini anlamak, 50 yılı aşkın bir süredir bir hedef olmuştur. Yüzey glomerüllü Münih Wistar sıçanları, fizyolojik ve patolojik süreçlerin birçok yönünü anlamak için mikroponktur çalışmaları da dahil olmak üzere bu çalışmalarda merkezi bir rol oynamıştır 1,2,3. Glomerüler bileşenleri intravital olarak incelemek için mikroskopinin kullanımı, bu toksik maruziyeti en aza indiren ve penetrasyon derinliğini artıran 2-foton mikroskobunun ortaya çıkmasına kadar fototoksisitenin etkileri nedeniyle sınırlıydı 1,2. Bilgisayar donanım ve yazılımındaki hızlı gelişmelerin yanı sıra, bu, tek bir ayarda saatlerce üç boyutlu (3B) ve dört boyutlu (zaman) çalışmalara izin vermiştir 1,4,5.
Glomerüler kılcal kan akımının miktarı, ilaçlara yanıt olarak vazokonstriksiyon ve dilatasyon, geçirgenlik ve yükün geçirgenlik ve inflamasyon üzerindeki etkileri, incelenen glomerüler süreçlerden sadece birkaçıdır. Ek olarak, proksimal tübülün S1 segmenti tanımlanabilir ve S1 ve S2 tübüler epitelinin davranışındaki farklılıklar 1,4 olarak ölçülebilir. Farelerde yapılan çalışmalar, özellikle fare transgenik tesislerinin evrensel mevcudiyeti ile, glomerüler hastalık süreçlerinin moleküler biyolojisinin anlaşılmasında hızlı ilerlemelere yol açmıştır. Bireysel proteinler, özellikle proteinüri 6,7,8 ile ilgili olarak, nakavt çalışmalarında glomerüler disfonksiyondan sorumludur. Bununla birlikte, glomerüler görüntüleme çalışmaları için fare modellerinin kullanımı, glomerüller incelenen çok sayıda suşta yüzeyin 100 μm’den daha az olduğu için sınırlandırılmıştır9.
Bu, araştırmacıların incelenebilecek yüzey glomerülleri ile sonuçlanan fare modellerini geliştirmelerine ve kullanmalarına neden olmuştur. En yaygın model, tam UUO10,11,12’nin kullanılmasıdır. Uzatılmış UUO periyodunun sonunda, farelerin böbreklerinde13,14 olabilen ve çalışılan çok sayıda yüzey glomerül vardır. Bu fare çalışmalarında, uzamış UUO’nun glomerüler biyoloji üzerindeki etkilerini belirlemek için herhangi bir temel veya kontrol çalışması yapılmamıştır. Bu, hızlı fibroz ve kortikal yıkımla sonuçlanan ciddi ve uzun süreli bir yaralanma modeli olduğu için10,11,12, glomerüler süreçler ve fonksiyon üzerinde etkiler olacağını varsaydık. Bu soruyu cevaplamak için, kontrol / taban çizgisi parametrelerini incelemek için yüzey glomerüllü Münih Wistar Fromter (MWF) sıçanları kullanıldı ve temel bulgu, beş haftalık UUO’yu takiben MWF sıçanlarında yapılan glomerüler çalışmalarla karşılaştırıldı. Ayrıca UUO’yu takiben yüzey glomerülleri olmayan Sprague Dawley (SD) sıçanlarını da inceledik. Bulgular, MWF ve SD sıçanlarda 5 haftalık UUO’nun yüzey glomerüllerinin sayısını gerçekten artırdığını göstermektedir. Bununla birlikte, bunlar glomerüler kan akışında, inflamasyonda ve makromolekül geçirgenliğinde ve boyutunda belirgin değişiklikler olan anormal glomerüllerdi.
Glomerüler fizyolojinin incelenmesi, özellikle mikroponktur kullanımı, izole glomerüllerin perfüzyonu ve mikroskopi gibi birçok farklı yaklaşım görmüştür. Münih Wistar sıçanlarında, Fromter ve Simonsen suşlarında yüzey glomerüllerinin mevcudiyeti, in vivo dinamik çalışmalara izin vermiştir. Bu teknolojiyi benimseyen araştırmacılara önemli bir not, çalışmalar arasında tutarlı görüntüleri korumak için edinme parametrelerini ayarlama ihtiyacıdır, böylece dokudaki otofloresan tutarlı kalır. Çift geçişli bir floresein/rodamin epifloresan küpü kullanmak ve bilgisayar ekranında göz merceklerinden görülenleri taklit etmek için kazanç ayarlarını yeşil ve kırmızı emisyon kanallarına ayarlamak, farklı mikroskop sistemleri arasında bile otofloresanda tutarlı bir renk imzası sağlayacaktır.
Fromter suşu, toplam glomerül sayısının azalması, ~% 75’i normal olduğu için yaygın olarak kullanılmıştır ve erkekler yaklaşık 12 haftalıkken kendiliğinden hipertansiyon geliştirir, ilerleyici proteinüri ve ardından fokal glomerüler skleroz ile sonunda böbrek yetmezliğinden ölürler12. Bu sıçanların kullanımı ve azaltılmış fototoksisitesi, gelişmiş penetrasyon derinliği ve aynı anda birden fazla floresan probu görüntüleme yeteneği ile 2-foton mikroskobunun eklenmesi, yeni keşiflerin yolunu açtı 1,4,5. Bilgisayar donanımı ve yazılımının gelişmesiyle birlikte, nicel veriler artık tüm 2-foton laboratuvarları için standarttır. Fizyolojik ve hastalık koşulları altında glomerüler, proksimal tübül, vasküler ve interstisyel süreçlere çoklu kantitatif teknikler geliştirilmiş ve uygulanmıştır 1,4,5,27,28,29,30.
Transgenik fare üretim tesisleri, böbrek fizyolojisi ve patolojisi çalışmalarına yeni bir boyut ekledi ve bu, spesifik gen ürünlerinin böbrek yapısı ve fonksiyonundaki önemini daha da tanımlamak için 2-foton mikroskobu ile birleştirilmesi sadece bir zaman meselesiydi. Bununla birlikte, fare glomerülleri, çok genç fareler hariç, böbrekyüzeyinden 100 μm’nin üzerinde bulunur 9. İki foton mikroskobu en iyi çözünürlük olarak 20 ila 50 μm arasında bir derinlikte gerçekleştirilir ve floresan yoğunluğu, yayılan ışığın ışık saçılması ve hemoglobin ile etkileşimden emilim nedeniyle hızla azalır. Bu nedenle, yüzey glomerüllerini indüklemek gerekliydi. Yaygın olarak kullanılan yaklaşım, 12 hafta boyunca uzatılmış tek taraflı bir obstrüksiyon modelidir. Bu modeller temel belirlemelere izin vermediğinden, UUO’nun etkilerinin çalışılan süreçten ayrılması mümkün değildir.
MWF sıçanlarını kullanarak, temel glomerüler fonksiyonu takip eden UUO ile karşılaştırabilirsiniz. Bu UUO modelinin inflamasyonu ve hızlı bir fibroz oranını indüklediği bilinmektedir ve KBH ve fibroz10,11,12’yi incelemek için kullanılmıştır. Beklendiği gibi, hem MWF hem de SD sıçanlarında yüzey glomerüllerinde bir artış oldu. Ayrıca, MWF ve SD sıçanları için UUO’yu takiben elde edilen nicel sonuçlar çok karşılaştırılabilirdi. Burada kaydedilen kan akışındaki azalma daha önce UUO’yu takip eden mikroskobik verileri mikroponktur verileriyle karşılaştırarak bildirilmişti3. Ayrıca, tübüler ve interstisyel histolojinin belirgin bir şekilde değiştiği ve PT’lerin burada bildirildiği gibi, albümin endositozu eksikliği ile çoğunlukla işlevsiz olduğu iyi bilinmektedir. Şekil 2 ve Şekil 3’teki çalışmalar, glomerüler ve peritübüler kılcal damarlarda RBC akış hızında dramatik bir azalma ve artmış WBC adezyonu göstermektedir. Akıştaki azalmalar muhtemelen WBC adezyonu ve rouleaux oluşumlarından kaynaklanan kılcal tıkanmalardan kaynaklanmaktadır.
Enflamasyonu daha iyi değerlendirmek için, albümin geçirgenliğini ölçtük ve on kat arttığını gösterdik. Ek olarak, izole glomerüller, daha önce çeşitli böbrek hastalığı durumlarında böbrek iltihabında arttığı bilinen birçok gen için mRNA ekspresyonunun arttığını göstermiştir 17,19,20,21,22,23,24,25,26 . Glomerüler yüzey yoğunluğundaki ve albümin geçirgenliğindeki artışlar, 12 haftalık UUO verilerinde gösterildiği gibi progresifti. Mevcut veriler, glomerüllerin UUO modelinde önemli yapısal hasar, inflamasyon ve moleküler değişikliklere uğradığını doğrudan gösteren ilk verilerdir. Sonuçlar, UUO’yu takiben koyun böbrek biyopsilerini analiz eden ve19’u yükselten çoklu inflamasyon belirteçleri bulan tüm böbrek dokusunun daha önceki bir çalışmasıyla tutarlıdır. Mevcut sonuçlar, daha önce sadece kortikal doku için bilinen glomerüllerde belirgin inflamasyon olduğunu göstermektedir.
Mevcut veriler, 12 haftalık posthidronefrotik ve normal glomerüller31 arasında adezyon molekülü ekspresyonu, kompleman birikimi ve nötrofil infiltrasyonunda herhangi bir değişiklik bulunmayan farelerde yapılan önceki çalışmalardan farklıdır. Ek olarak, Hickey laboratuvarı, farelerin glomerüllerinde bağışıklık reaksiyonlarını incelemek için 12 haftalık UUO modelini kullandı. Dört haftalık fare glomerülleri ile postobstrüktif glomerüller arasında nötrofil infiltrasyonunda fark bulamadılar32,33. Bu daha sonraki çalışmalar, tıkanmış böbreğin pelvisi idrardan boşaltıldıktan sonra yapıldı. Bunu, UUO’nun glomerüler fonksiyon üzerindeki etkisini, obstrüksiyona neden olan sıvıyı yapay olarak çıkarmadan, in vivo olacağı gibi belirlemek istediğimiz için yapmadık. Son olarak, farelerde UUO kullanımı, yüzeyin altında 100 μm’den daha büyük görüntüleme glomerülleri ile değiştirilmektedir. Mümkün olsa da, çözünürlük ve yoğunlukta bir denge vardır, her ikisi de 50 μm34’ün ötesine geçtikçe önemli ölçüde azalır.
Histolojik değişiklikler, tübüler glomerül oluşumu, inflamasyon, fibrozis, hemodinamik10,11,12 ile ilgili mevcut literatürdeki verilerin bir araya getirilmesi şaşırtıcı değildir. WBC adezyonu, rouleaux oluşumları, glomerüler moleküler inflamasyon belirteçleri ve artmış albümin geçirgenliği dahil olmak üzere sunulan veriler, bu UUO modelinde beş haftada bile devam eden ve on iki haftada bile mevcut olan kapsamlı inflamasyonu göstermektedir. Açıkçası, kronik UUO fizyolojik bir durum değildir ve yüzey glomerüllerini indüklemek için UUO’nun kullanılması bir yaralanma modelini temsil eder. Fizyolojik koşullar altında yüzey glomerüllerine sahip olan MWF sıçanları, yaralanma meydana geldikçe uzunlamasına incelenebilir. Transgenik sıçanlar üretmek mümkündür ve çok sayıda araştırmacı bunları belirli sorular sormak için biyosensörlerle yaratmaktadır. Özellikle, Wisconsin Tıp Fakültesi şimdi MWF sıçanlarının bir kolonisine sahiptir ve fizyolojik ve patolojik koşullar altında glomerüler süreçleri incelemek amacıyla transgenik sıçanlar yapmıştır. Bu MWF sıçanları, normal, hastalıklı ve genetiği değiştirilmiş sıçanlarda glomerüler süreçleri incelemek için harika bir fırsat sunmaktadır.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü tarafından desteklenmiştir RO1DK091623 ve P30DK079312 (B.A.M.’ye). Michigan State Üniversitesi’ndeki Araştırma Teknolojisi Destek Tesisi’nin (RTSF) Genomik Çekirdek Tesisi’ndeki personele Nanostring analizini gerçekleştirdikleri için teşekkür ederiz.
70 µm sterile cell strainer | Corning | #421751 | |
100 µm sterile cell strainer | Corning | #421752 | |
CA Micro scissors Model 1C300 | Electron Microscopy Sciences | Cat# 72930 | |
Electric heating pad | Sunbeam | Kroger | |
Handling Forceps | Electron Microscopy Sciences | Cat# 72962 | |
Kelly Hemostatic Forceps (straight) | Electron Microscopy Sciences | Cat#72930 | |
Leica Dive SP-8 Multi-Photon Inverted Microscope | Leica Microsystems | Note: Version 7.1r1 | |
MaiTai DeepSee titanium-sapphire laser | Spectra-Physics | NA | |
Mayo Dissecting Scissors | Electron Microscopy Sciences | Cat# 78180-1C3 | |
Metamorph Image processing Software | Molecular Dynamics | Cat# 78266-04 | |
Microsoft Excel | Microsoft Corportation | 2007 version | |
Quant-iT RNA Assay Kit | Invitrogen/ThermoFisher | Q33140 | |
Reptitherm Undertank Heater | Zoomed | Amazon | |
RNeasy MinElute Cleanup Kit (Spin columns) | Qiagen | 74204 | |
RPE buffer | Qiagen | 1018013 | |
Strate-Line Autoclave Tape | Fisher Scientific | Cat# 11-889-1 | |
TRI Reagent | Sigma | T9424 | |
Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip) | Electron Microscopy Sciences | Cat# 70665-07 |