pH'a duyarlı Floresan Lipid Analog ND6 ile Membran Lipid Devir Hızının Ölçülmesi

Lipid çift tabakası, en yaygın biyomolekül düzeneklerinden biridir ve tüm hücreler için vazgeçilmezdir. Hücrelerin dışında, hücreleri ve çevrelerini birbirine bağlayan plazma zarını oluşturur; Hücrelerin içinde, belirlenmiş işlevler için özelleşmiş çeşitli organelleri bölümlere ayırır. Durgundan ziyade dinamik olan lipid zarları, biyomateryal taşınımı, organel reformunu, morfoloji değişimini ve hücresel iletişimi aracılık eden sürekli olarak füzyon ve fisyon yaşar. Kuşkusuz, lipid zarı hemen hemen tüm hücresel süreçlerin fiziksel temelidir ve işlev bozukluğu, kanser^1’den Alzheimer hastalığı^2’ye kadar çeşitli bozukluklarda çok önemli bir rol oynar. Lipid molekülleri proteinlerden çok daha az çeşitli olmasına rağmen, şimdiye kadar yapılan zar araştırmaları esas olarak protein merkezli olmuştur. Örneğin, protein makineleri hakkında ekzositozdaki lipitlerden çok daha fazla şey bilinmektedir ^3,4,5. Ayrıca, yüzey ve hücre içi zarlar boyunca lipitlerin organizasyonu, dağılımı, dinamikleri ve homeostazı, zar proteinlerine kıyasla büyük ölçüde keşfedilmemiş kalmaktadır⁶.

Mutajenez gibi modern moleküler biyoloji teknikleri, lipitlerden ziyade proteinleri incelemek için metodolojik bir avantaj sağladığından, bu şaşırtıcı değildir. Örneğin, pH’a duyarlı yeşil floresan proteinin (diğer adıyla pHluorin) veziküler proteinlere transgenik olarak etiketlenmesi, ekzo-/endositoz ^7,8,9 sırasında veziküler protein devir miktarının ve hızının kantitatif ölçümünü kolaylaştırır. Bununla birlikte, membran lipidlerini in vivo olarak genetik olarak değiştirmek neredeyse imkansızdır. Ayrıca, protein miktarlarının ve dağılımlarının kalitatif ve hatta kantitatif manipülasyonları, lipitlerinkinden çok daha uygundur¹⁰. Bununla birlikte, doğal ve sentetik floresan lipidler, endojen membran lipidlerini in vitro ve in vivo¹¹ simüle etmek için izole edilmiş ve geliştirilmiştir. Yaygın olarak kullanılan floresan lipitlerin bir grubu, membranla geliştirilmiş floresan sergileyen ve nöronlarda sinaptik vezikül (SV) salınımını incelemede güçlü bir araç olan FM1-43 gibi stiril boyalardır¹². Son zamanlarda, çevreye duyarlı lipid boyalar icat edildi ve zar potansiyeli¹¹, faz sırası¹³ ve sekresyon¹⁴ dahil olmak üzere çeşitli hücre zarı özelliklerini incelemek için yeni bir raportör sınıfı olarak yaygın olarak kullanıldı.

Floresansı hem pH’a duyarlı (örneğin, pHluorin) hem de membrana duyarlı (örneğin, FM1-43) olan yeni bir lipid mimetiği sınıfı, plazma zarındaki ve endozomlar/lizozomlardaki lipid dağılımını ve ekzo-/endositoz sırasındaki lipid trafiğini doğrudan ölçmek için geliştirilmiştir. Bu amaçla, molekül içi yük transferine bağlı itme-çekme özellikleri gösteren iyi bilinen solvatokromik floroforlar seçilmiştir. Mevcut solvatokromik floroforlar arasında, 1,8-naftalimid (ND) iskelesinin değiştirilmesi nispeten kolaydır, etiketleme için çok yönlüdür ve foto-fizikte^{benzersizdir 15} ve bu nedenle DNA interkalatörlerinde, organik ışık yayan diyotlarda ve biyomolekül sensörlerinde^{kullanılmıştır} 16,17,18.

ND iskelesinin C4 konumuna elektron veren bir grubun bağlanması, elektron yoğunluğunu^{uyarılmış durumda 19,20} yeniden dağıtarak artan bir dipol momentine yol açan bir itme-çekme yapısı oluşturur. Böyle bir molekül içi yük transferi, büyük kuantum verimleri ve Stokes kaymaları üreterek parlak ve kararlı floresan²¹ ile sonuçlanır. Bu grup yakın zamanda ND iskelesine dayalı bir dizi solvatokromik lipid analoğu geliştirmiş ve bunları iyi sentetik verimlerle^{elde etmiştir 20}.

Spektroskopik karakterizasyon, bu ürünler arasında ND6’nın en iyi floresan özelliklerine sahip olduğunu göstermektedir (Şekil 1)²⁰. İlk olarak, floresein izotiyosiyanat, rodamin veya GFP gibi popüler floroforlara kıyasla iyi ayrılmış uyarma ve emisyon tepe noktalarına (yani, Şekil 2A, B’de sırasıyla ~400 nm ve ~520 nm) sahiptir, bu da onu spektral olarak onlardan ayrılabilir hale getirir ve bu nedenle çok renkli görüntüleme için kullanışlıdır. İkincisi, ND6 floresansı, misellerin varlığında floresansında sekiz kattan fazla bir artış sergiler (Şekil 2C), bu da güçlü bir membran bağımlılığını düşündürür. Farklı hücre tipleri ile yapılan önceki canlı hücre floresan görüntüleme çalışmaları, ND6²⁰ ile mükemmel membran boyaması göstermiştir. Üçüncüsü, çözeltinin pH’ı 7.5’ten (genellikle hücre dışı veya sitozolik ortamlarda bulunur) 5.5’e (genellikle endozomlarda ve lizozomlarda bulunur) düşürüldüğünde, ND6 floresanda yaklaşık iki kat artış gösterir (Şekil 2D), pH duyarlılığını gösterir. Ayrıca, moleküler dinamik simülasyonu, ND6’nın, fosfolipid baş grupları ile güçlü etkileşimler gösteren membran ve piperazin kalıntısından dışarı bakan ND iskelesi ile lipid çift tabakasına kolayca entegre olduğunu göstermektedir (Şekil 3). Toplamda, bu özellikler ND6’yı ekzo-/endositoz sırasında membran lipid döngüsünü görselleştirmek ve ölçmek için ideal bir floresan lipid analoğu yapar.

Bu makale, kültürlenmiş fare hipokampal nöronlarını kullanarak SV lipidlerinin devir hızını ve dinamiklerini incelemek için bir yöntem sunmaktadır. Yüksek K⁺ Tyrode çözeltileri ile nöronları uyararak, SV’ler ve plazma membranı ND6 ile yüklendi (Şekil 4A,B). Daha sonra, nöronlar farklı uyaranlarla yeniden uyarıldı, ardından NH₄Cl içeren ve pH 5.5 Tyrode çözeltileri izledi (Şekil 4D). Bu protokol, farklı koşullar altında birleştirilmiş ekzositoz ve endositoz oranlarının kantitatif ölçümünü kolaylaştırır (Şekil 4C).