Измерение липидного обмена в мембранах с помощью pH-чувствительного флуоресцентного аналога липидов ND6

Липидный бислой является одной из наиболее распространенных сборок биомолекул и незаменим для всех клеток. Вне клеток он образует плазматическую мембрану, соединяющую клетки с окружающей средой; Внутри клеток он разделяет различные органеллы, специализированные для определенных функций. Липидные мембраны, скорее динамичные, чем неподвижные, постоянно испытывают слияние и деление, что опосредует транспорт биоматериала, преобразование органелл, изменение морфологии и клеточную коммуникацию. Несомненно, липидная мембрана является физической основой практически всех клеточных процессов, и ее дисфункция играет решающую роль при различных расстройствах, начиная от рака¹ и заканчивая болезнью Альцгеймера². Хотя молекулы липидов гораздо менее разнообразны, чем белки, мембранные исследования до сих пор были в основном ориентированы на белки. Например, о белковых механизмах известно гораздо больше, чем о липидах при экзоцитозе ^3,4,5. Более того, организация, распределение, динамика и гомеостаз липидов через поверхностные и внутриклеточные мембраны в значительной степени остаются неизученными по сравнению с мембранными белками⁶.

Это неудивительно, поскольку современные методы молекулярной биологии, такие как мутагенез, дают методологическое преимущество для изучения белков, а не липидов. Например, трансгенное мечение pH-чувствительного зеленого флуоресцентного белка (также известного как pHluorin) к везикулярным белкам облегчает количественное измерение количества и скорости обновления везикулярного белка при экзо-/эндоцитозе ^7,8,9. Однако генетически модифицировать мембранные липиды in vivo практически невозможно. Более того, качественные и даже количественные манипуляции с количеством и распределением белка гораздо более осуществимы, чем манипуляции с липидами¹⁰. Тем не менее, нативные и синтетические флуоресцентные липиды были выделены и разработаны для моделирования эндогенных мембранных липидов in vitro и in vivo¹¹. Одной из групп широко используемых флуоресцентных липидов являются стириловые красители, например, FM1-43, которые проявляют мембраноусиленную флуоресценцию и являются мощным инструментом в изучении высвобождения синаптических везикул (SV) в нейронах¹². В последнее время были изобретены чувствительные к окружающей среде липидные красители, которые широко используются в качестве нового класса для изучения различных свойств клеточных мембран, включая мембранный потенциал¹¹, фазовый порядок¹³ и секрецию¹⁴.

Новый класс липидных миметиков, флуоресценция которых является одновременно pH-чувствительной (например, pHluorin) и мембраночувствительной (например, FM1-43), был разработан для непосредственного измерения распределения липидов в плазматической мембране и эндосомах/лизосомах, а также липидного трафика во время экзо-/эндоцитоза. Для этого были выбраны известные сольватохромные флуорофоры, обладающие двухтактными характеристиками за счет внутримолекулярного переноса заряда. Среди существующих сольватохромных флуорофоров 1,8-нафталимидный (ND) скаффолд относительно легко модифицируется, универсален для мечения и является уникальным в фотофизике¹⁵ и поэтому используется в ДНК-интеркаляторах, органических светодиодах и биомолекулярных сенсорах 16,17,18.

Присоединение электрон-донорной группы к положению С4 ND-каркаса генерирует двухтактную структуру, которая приводит к увеличению дипольного момента за счет перераспределения электронной плотности в возбужденном состоянии^19,20. Такой внутримолекулярный перенос заряда приводит к большим квантовым выходам и сдвигам Стокса, что приводит к яркой и стабильной флуоресценции²¹. Эта группа недавно разработала серию сольватохромных аналогов липидов на основе ND-скаффолда и получила их с хорошими синтетическими выходами²⁰.

Спектроскопическая характеристика показывает, что среди этих продуктов ND6 обладает наилучшими флуоресцентными свойствами (рис. 1)²⁰. Во-первых, он имеет хорошо разделенные пики возбуждения и излучения (т.е. ~400 нм и ~520 нм соответственно на рисунке 2A, B) по сравнению с популярными флуорофорами, такими как флуоресцеин изотиоцианат, родамин или GFP, что делает его спектрально отделимым от них и, таким образом, полезным для многоцветной визуализации. Во-вторых, флуоресценция ND6 демонстрирует более чем восьмикратное увеличение своей флуоресценции в присутствии мицелл (рис. 2C), что указывает на сильную мембранозависимость. Предыдущие исследования флуоресцентной визуализации живых клеток с различными типами клеток показали превосходное окрашивание мембран ND6²⁰. В-третьих, когда рН раствора снижается с 7,5 (обычно встречается во внеклеточной или цитозольной среде) до 5,5 (обычно обнаруживается в эндосомах и лизосомах), ND6 показывает примерно двукратное увеличение флуоресценции (рис. 2D), что свидетельствует о его чувствительности к рН. Более того, молекулярно-динамическое моделирование показывает, что ND6 легко интегрируется в липидный бислой, при этом его ND-каркас обращен наружу из мембраны, а остаток пиперазина демонстрирует сильное взаимодействие с фосфолипидными головными группами (рис. 3). В совокупности эти особенности делают ND6 идеальным флуоресцентным аналогом липидов для визуализации и измерения мембранного липидного обмена во время экзо-/эндоцитоза.

В данной работе представлен метод исследования скорости обновления и динамики липидов SV с использованием культивируемых нейронов гиппокампа мыши. Стимулируя нейроны растворами Тироде с высоким содержанием К⁺, SV и плазматическую мембрану нагружали ND6 (рис. 4A,B). В дальнейшем нейроны рестимулировали различными стимулами с последующим введением растворов NH₄Cl и pH 5,5 Тироде (рис. 4D). Этот протокол облегчает количественное измерение скорости собранного экзоцитоза и эндоцитоза при различных обстоятельствах (рис. 4C).