Misurazione del turnover lipidico di membrana con l'analogo lipidico fluorescente ND6 sensibile al pH

Il doppio strato lipidico è uno degli assemblaggi di biomolecole più comuni ed è indispensabile per tutte le cellule. All’esterno delle cellule, forma la membrana plasmatica che interfaccia le cellule e il loro ambiente; All’interno delle cellule, compartimenta vari organelli specializzati per le funzionalità designate. Piuttosto dinamiche che ferme, le membrane lipidiche sperimentano costantemente la fusione e la fissione, che media il trasporto di biomateriali, la riforma degli organelli, il cambiamento morfologico e la comunicazione cellulare. Indubbiamente, la membrana lipidica è la base fisica di quasi tutti i processi cellulari e la sua disfunzione svolge un ruolo cruciale in vari disturbi che vanno dal cancro¹ al morbo di Alzheimer². Sebbene le molecole lipidiche siano molto meno diversificate delle proteine, la ricerca sulle membrane finora è stata principalmente incentrata sulle proteine. Ad esempio, si sa molto di più sul macchinario proteico che sui lipidi nell’esocitosi ^3,4,5. Inoltre, l’organizzazione, la distribuzione, la dinamica e l’omeostasi dei lipidi attraverso le membrane superficiali e intracellulari rimangono in gran parte inesplorate rispetto alle proteine di membrana⁶.

Ciò non sorprende in quanto le moderne tecniche di biologia molecolare, come la mutagenesi, forniscono un vantaggio metodologico per lo studio delle proteine piuttosto che dei lipidi. Ad esempio, la marcatura transgenica della proteina fluorescente verde sensibile al pH (nota anche come pHluorin) alle proteine vescicolari facilita la misurazione quantitativa della quantità e del tasso di turnover delle proteine vescicolari durante l’eso-/endocitosi ^7,8,9. Tuttavia, è quasi impossibile modificare geneticamente i lipidi di membrana in vivo. Inoltre, le manipolazioni qualitative e persino quantitative delle quantità e delle distribuzioni delle proteine sono molto più fattibili di quelle dei lipidi¹⁰. Ciononostante, lipidi fluorescenti nativi e sintetici sono stati isolati e sviluppati per simulare lipidi endogeni di membrana in vitro e in vivo¹¹. Un gruppo di lipidi fluorescenti ampiamente utilizzati sono i coloranti stirilici, ad esempio FM1-43, che mostrano una fluorescenza potenziata dalla membrana e sono un potente strumento nello studio del rilascio di vescicole sinaptiche (SV) nei neuroni¹². Ultimamente, i coloranti lipidici sensibili all’ambiente sono stati inventati e ampiamente utilizzati come una nuova classe di reporter per studiare varie proprietà della membrana cellulare, tra cui il potenziale di membrana¹¹, l’ordine di fase¹³ e la secrezione¹⁴.

È stata sviluppata una nuova classe di mimetici lipidici la cui fluorescenza è sia sensibile al pH (ad esempio, pHluorin) che sensibile alla membrana (ad esempio, FM1-43) per misurare direttamente la distribuzione dei lipidi nella membrana plasmatica e negli endosomi/lisosomi e il traffico lipidico durante l’eso-/endocitosi. A questo scopo sono stati selezionati i ben noti fluorofori solvatocromici che presentano caratteristiche push-pull dovute al trasferimento di carica intramolecolare. Tra i fluorofori solvatocromici esistenti, lo scaffold di 1,8-naftalimmide (ND) è relativamente facile da modificare, versatile per la marcatura ed è unico in fotofisica¹⁵ ed è stato quindi utilizzato in intercalatori di DNA, diodi organici emettitori di luce e sensori di biomolecole 16,17,18.

Il collegamento di un gruppo donatore di elettroni alla posizione C4 dello scaffold ND genera una struttura push-pull, che porta ad un aumento del momento di dipolo ridistribuendo la densità elettronica nello stato eccitato^19,20. Un tale trasferimento di carica intramolecolare produce grandi rese quantistiche e spostamenti di Stokes, con conseguente fluorescenza^{luminosa e stabile 21}. Questo gruppo ha recentemente sviluppato una serie di analoghi lipidici solvatocromici basati sullo scaffold ND e li ha ottenuti con buone rese sintetiche²⁰.

La caratterizzazione spettroscopica mostra che, tra questi prodotti, ND6 possiede le migliori proprietà di fluorescenza (Figura 1)²⁰. In primo luogo, ha picchi di eccitazione ed emissione ben separati (cioè, ~ 400 nm e ~ 520 nm, rispettivamente, nella Figura 2A, B) rispetto ai fluorofori popolari come l’isotiocianato di fluoresceina, la rodamina o la GFP, rendendolo spettralmente separabile da loro e quindi utile per l’imaging multicolore. In secondo luogo, la fluorescenza ND6 mostra un aumento di oltre otto volte della sua fluorescenza in presenza di micelle (Figura 2C), suggerendo una forte dipendenza dalla membrana. Precedenti studi di imaging a fluorescenza su cellule vive con diversi tipi di cellule hanno mostrato un’eccellente colorazione della membrana con ND6²⁰. In terzo luogo, quando il pH della soluzione è diminuito da 7,5 (che si trova comunemente in ambienti extracellulari o citosolici) a 5,5 (che si trova comunemente negli endosomi e nei lisosomi), ND6 mostra un aumento di circa due volte della fluorescenza (Figura 2D), mostrando la sua sensibilità al pH. Inoltre, la simulazione della dinamica molecolare indica che ND6 si integra prontamente nel doppio strato lipidico con la sua impalcatura ND rivolta verso l’esterno della membrana e il residuo di piperazina che mostra forti interazioni con i gruppi di testa dei fosfolipidi (Figura 3). Nel complesso, queste caratteristiche rendono ND6 un analogo lipidico fluorescente ideale per visualizzare e misurare il turnover lipidico di membrana durante l’eso-/endocitosi.

Questo articolo presenta un metodo per studiare il tasso di turnover e la dinamica dei lipidi SV utilizzando neuroni ippocampali di topo in coltura. Stimolando i neuroni con soluzioni di tirodo ad alto K⁺, le SV e la membrana plasmatica sono state caricate con ND6 (Figura 4A,B). Successivamente, i neuroni sono stati ristimolati con diversi stimoli seguiti da soluzioni contenenti NH₄Cl e pH 5,5 di Tyrode (Figura 4D). Questo protocollo facilita la misurazione quantitativa dei tassi di esocitosi ed endocitosi assemblati in diverse circostanze (Figura 4C).