Medindo o Turnover Lipídico da Membrana com o Análogo Lipídico Fluorescente Sensível ao pH ND6

A bicamada lipídica é um dos conjuntos de biomoléculas mais comuns e é indispensável para todas as células. Fora das células, forma a membrana plasmática que faz interface com as células e seu ambiente; Dentro das células, compartimentaliza várias organelas especializadas para designar funcionalidades. Mais dinâmicas do que paradas, as membranas lipídicas experimentam constantemente fusão e fissão, o que medeia o transporte de biomateriais, a reforma da organela, a mudança morfológica e a comunicação celular. Sem dúvida, a membrana lipídica é a base física para quase todos os processos celulares, e sua disfunção desempenha um papel crucial em várias desordens que vão desde o câncer¹ até a doença de Alzheimer². Embora as moléculas lipídicas sejam muito menos diversas do que as proteínas, a pesquisa de membrana até agora tem sido principalmente centrada em proteínas. Por exemplo, sabe-se muito mais sobre a maquinaria proteica do que sobre os lipídios na exocitose ^3,4,5. Além disso, a organização, distribuição, dinâmica e homeostase dos lipídios através das membranas superficiais e intracelulares permanecem em grande parte inexploradas em comparação com as proteínas de membrana⁶.

Isso não é surpreendente, pois técnicas modernas de biologia molecular, como a mutagênese, fornecem uma vantagem metodológica para estudar proteínas em vez de lipídios. Por exemplo, a marcação transgênica de proteína verde fluorescente sensível ao pH (também conhecida como pHluorina) para proteínas vesiculares facilita a medida quantitativa da quantidade e taxa de turnover proteico vesicular durante a exo-/endocitose ^7,8,9. No entanto, é quase impossível modificar geneticamente os lipídios da membrana in vivo. Além disso, manipulações qualitativas e mesmo quantitativas de quantidades e distribuições de proteínas são muito mais viáveis do que as de lipídios¹⁰. No entanto, lipídios fluorescentes nativos e sintéticos têm sido isolados e desenvolvidos para simular lipídios de membrana endógena in vitro e in vivo¹¹. Um grupo de lipídios fluorescentes amplamente utilizado são os corantes estiril, por exemplo, FM1-43, que exibem fluorescência realçada por membrana e são uma ferramenta poderosa no estudo da liberação de vesículas sinápticas (VS) em neurônios¹². Ultimamente, corantes lipídicos sensíveis ao ambiente têm sido inventados e amplamente utilizados como uma nova classe de repórteres para estudar várias propriedades da membrana celular, incluindo potencial de membrana¹¹, ordem de fase¹³ e secreção¹⁴.

Uma nova classe de miméticos lipídicos cuja fluorescência é sensível ao pH (por exemplo, pHluorina) e sensível à membrana (por exemplo, FM1-43) foi desenvolvida para medir diretamente a distribuição lipídica na membrana plasmática e endossomos/lisossomos e o tráfego lipídico durante a exo-/endocitose. Os conhecidos fluoróforos solvatocrômicos exibindo características push-pull devido à transferência de carga intramolecular foram selecionados para este propósito. Dentre os fluoróforos solvatocrômicos existentes, o arcabouço 1,8-naftalimida (ND) é relativamente fácil de modificar, versátil para marcação, único em fotofísica¹⁵ e, portanto, tem sido utilizado em intercaladores de DNA, diodos orgânicos emissores de luz e sensores de biomoléculas 16,17,18.

A ligação de um grupo doador de elétrons à posição C4 do arcabouço ND gera uma estrutura push-pull, que leva a um aumento do momento dipolar ao redistribuir a densidade eletrônica no estado excitado^19,20. Tal transferência de carga intramolecular produz grandes rendimentos quânticos e desvios de Stokes, resultando em fluorescência brilhante e estável²¹. Recentemente, esse grupo desenvolveu uma série de análogos lipídicos solvatocrômicos baseados no arcabouço ND e os obteve com bons rendimentos sintéticos²⁰.

A caracterização espectroscópica mostra que, dentre esses produtos, o ND6 possui as melhores propriedades de fluorescência (Figura 1)²⁰. Primeiro, ele tem picos de excitação e emissão bem separados (ou seja, ~400 nm e ~520 nm, respectivamente, na Figura 2A,B) em comparação com fluoróforos populares como isotiocianato de fluoresceína, rodamina ou GFP, tornando-o espectralmente separável deles e, portanto, útil para imagens multicoloridas. Em segundo lugar, a fluorescência ND6 exibe um aumento de mais de oito vezes em sua fluorescência na presença de micelas (Figura 2C), sugerindo uma forte dependência de membrana. Estudos prévios de fluorescência de células vivas com diferentes tipos de células mostraram excelente coloração de membrana por ND6²⁰. Terceiro, quando o pH da solução é diminuído de 7,5 (comumente encontrado em ambientes extracelulares ou citosólicos) para 5,5 (comumente encontrado em endossomos e lisossomos), o ND6 mostra um aumento de aproximadamente duas vezes na fluorescência (Figura 2D), mostrando sua sensibilidade ao pH. Além disso, a simulação de dinâmica molecular indica que o ND6 se integra prontamente à bicamada lipídica com seu arcabouço ND voltado para fora da membrana e do resíduo de piperazina mostrando fortes interações com grupos de cabeças de fosfolipídios (Figura 3). Em conjunto, essas características fazem do ND6 um análogo lipídico fluorescente ideal para visualizar e medir o turnover lipídico da membrana durante a exo-/endocitose.

Este trabalho apresenta um método para estudar a taxa de turnover e a dinâmica de lipídios SV usando cultura de neurônios hipocampais de camundongos. Ao estimular neurônios com soluções de Tyrode, com alto teor de K⁺, as VS e a membrana plasmática foram carregadas com ND6 (Figura 4A,B). Posteriormente, os neurônios foram reestimulados com diferentes estímulos, seguidos por soluções de NH₄Cl e pH 5,5 de Tyrode (Figura 4D). Esse protocolo facilita a mensuração quantitativa das taxas de exocitose e endocitose montadas em diferentes circunstâncias (Figura 4C).