قياس معدل دوران الدهون الغشائية باستخدام التناظرية الفلورية الحساسة للأس الهيدروجيني ND6
Summary
يقدم هذا البروتوكول طريقة تصوير مضان تستخدم فئة من الفلوروفورات الدهنية الحساسة لدرجة الحموضة لمراقبة الاتجار بالغشاء الدهني أثناء الإخراج الخلوي للخلايا ودورة التداخل الخلوي.
Abstract
Exo- / endocytosis هي عملية شائعة تتوسط في تبادل الجزيئات الحيوية بين الخلايا وبيئتها وبين الخلايا المختلفة. تستخدم الخلايا المتخصصة هذه العملية لتنفيذ وظائف الجسم الحيوية مثل إفراز الأنسولين من الخلايا β وإطلاق الناقل العصبي من المشابك الكيميائية. نظرا لأهميته الفسيولوجية ، كان exo-/ endocytosis أحد أكثر الموضوعات التي تمت دراستها في بيولوجيا الخلية. تم تطوير العديد من الأدوات لدراسة هذه العملية على مستوى الجينات والبروتين ، والتي بسببها يعرف الكثير عن آلية البروتين المشاركة في هذه العملية. ومع ذلك ، فقد تم تطوير عدد قليل جدا من الطرق لقياس معدل دوران الدهون الغشائية ، وهو الأساس المادي للخارج / البطانة الخلوية.
تقدم هذه الورقة فئة من نظائر الدهون الفلورية الجديدة التي تظهر مضان يعتمد على الأس الهيدروجيني وتوضح استخدامها لتتبع إعادة تدوير الدهون بين غشاء البلازما والحويصلات الإفرازية. بمساعدة التلاعب البسيط بالأس الهيدروجيني ، تسمح هذه النظائر أيضا بالقياس الكمي لتوزيع الدهون عبر السطح ومقصورات الغشاء داخل الخلايا ، بالإضافة إلى قياس معدل دوران الدهون أثناء التداخل الخلوي الخارجي. سيكون هؤلاء المراسلون الجدد للدهون موضع اهتمام كبير لمختلف مجالات البحث البيولوجي مثل بيولوجيا الخلية وعلم الأعصاب.
Introduction
الطبقة الثنائية الدهنية هي واحدة من أكثر مجموعات الجزيئات الحيوية شيوعا ولا غنى عنها لجميع الخلايا. الخلايا الخارجية ، فإنه يشكل الخلايا التي تربط غشاء البلازما وبيئتها. داخل الخلايا ، فإنه يقسم عضيات مختلفة متخصصة في وظائف معينة. بدلا من أن تكون الأغشية الدهنية ديناميكية أكثر من كونها ثابتة ، فإنها تشهد باستمرار الاندماج والانشطار ، مما يتوسط في نقل المواد الحيوية ، وإصلاح العضيات ، وتغيير التشكل ، والاتصال الخلوي. مما لا شك فيه أن الغشاء الدهني هو الأساس المادي لجميع العمليات الخلوية تقريبا ، ويلعب اختلاله الوظيفي دورا حاسما في اضطرابات مختلفة تتراوح من السرطان1 إلى مرض الزهايمر2. على الرغم من أن جزيئات الدهون أقل تنوعا بكثير من البروتينات ، إلا أن أبحاث الأغشية حتى الآن كانت تتمحور بشكل أساسي حول البروتين. على سبيل المثال ، يعرف الكثير عن آلات البروتين أكثر من الدهون في الإخراج الخلوي3،4،5. علاوة على ذلك ، فإن تنظيم وتوزيع وديناميكيات وتوازن الدهون عبر الأغشية السطحية وداخل الخلايا لا تزال غير مستكشفة إلى حد كبير مقارنة بالبروتينات الغشائية6.
هذا ليس مفاجئا لأن تقنيات البيولوجيا الجزيئية الحديثة ، مثل الطفرات ، توفر ميزة منهجية لدراسة البروتينات بدلا من الدهون. على سبيل المثال ، يسهل وضع العلامات المعدلة وراثيا للبروتين الفلوري الأخضر الحساس للأس الهيدروجيني (المعروف أيضا باسم pHluorin) إلى البروتينات الحويصلية القياس الكمي لكمية ومعدل دوران البروتين الحويصلي أثناء الإخراج الخلوي / التداخلالخلوي 7،8،9. ومع ذلك ، يكاد يكون من المستحيل تعديل الدهون الغشائية وراثيا في الجسم الحي. علاوة على ذلك ، فإن التلاعب النوعي وحتى الكمي بكميات البروتين وتوزيعاته أكثر جدوى من تلك الموجودة في الدهون10. ومع ذلك ، تم عزل الدهون الفلورية الأصلية والاصطناعية وتطويرها لمحاكاة الدهون الغشائية الداخلية في المختبر وفي الجسم الحي11. مجموعة واحدة من الدهون الفلورية المستخدمة على نطاق واسع هي أصباغ الستيريل ، على سبيل المثال ، FM1-43 ، والتي تظهر مضان معزز بالغشاء وهي أداة قوية في دراسة إطلاق الحويصلة المشبكية (SV) في الخلايا العصبية12. في الآونة الأخيرة ، تم اختراع أصباغ دهنية حساسة للبيئة واستخدامها على نطاق واسع كفئة جديدة من المراسلين لدراسة خصائص غشاء الخلية المختلفة ، بما في ذلك إمكانات الغشاء11 ، وترتيب الطور13 ، والإفراز14.
تم تطوير فئة جديدة من محاكيات الدهون التي يكون مضانها حساسا لدرجة الحموضة (على سبيل المثال ، pHluorin) وحساسا للغشاء (على سبيل المثال ، FM1-43) لقياس توزيع الدهون مباشرة في غشاء البلازما والإندوسومات / الليزوزومات وحركة الدهون أثناء الإخراج الخلوي / البطانة الداخلية. تم اختيار فلوروفورات solvatochromic المعروفة التي تظهر خصائص الدفع والسحب بسبب نقل الشحنة داخل الجزيئات لهذا الغرض. من بين الفلوروفورات الحلفاتوكرومية الموجودة ، فإن سقالة 1،8-naphthalimide (ND) سهلة التعديل نسبيا ، ومتعددة الاستخدامات لوضع العلامات ، وهي فريدة من نوعها في الفيزياء الضوئية15 ، وبالتالي تم استخدامها في مقحمات الحمض النووي ، والثنائيات العضوية الباعثة للضوء ، وأجهزة استشعار الجزيئات الحيوية16،17،18.
يؤدي ربط مجموعة مانحة للإلكترون بموضع C4 لسقالة ND إلى توليد هيكل دفع وسحب ، مما يؤدي إلى زيادة عزم ثنائي القطب عن طريق إعادة توزيع كثافة الإلكترون في الحالة المثارة19,20. ينتج عن نقل الشحنة داخل الجزيئات عوائد كمية كبيرة وتحولات ستوكس ، مما يؤدي إلى مضان ساطع ومستقر21. طورت هذه المجموعة مؤخرا سلسلة من نظائر الدهون المذابة على أساس سقالة ND وحصلت عليها بإنتاجية اصطناعية جيدة20.
يظهر التوصيف الطيفي أنه من بين هذه المنتجات ، يمتلك ND6 أفضل خصائص مضان (الشكل 1)20. أولا ، لديها قمم إثارة وانبعاث منفصلة جيدا (أي ~ 400 نانومتر و ~ 520 نانومتر ، على التوالي ، في الشكل 2A ، B) مقارنة بالفلوروفورات الشائعة مثل الفلوريسئين أيزوثيوسيانات أو رودامين أو GFP ، مما يجعلها قابلة للفصل الطيفي عنها وبالتالي فهي مفيدة للتصوير متعدد الألوان. ثانيا ، يظهر مضان ND6 زيادة بأكثر من ثمانية أضعاف في مضانه في وجود المذيلات (الشكل 2C) ، مما يشير إلى اعتماد قوي على الغشاء. أظهرت دراسات التصوير الفلوري السابقة للخلايا الحية مع أنواع مختلفة من الخلايا تلطيخا غشائيا ممتازا بواسطة ND620. ثالثا ، عندما ينخفض الرقم الهيدروجيني للمحلول من 7.5 (يوجد عادة في البيئات خارج الخلية أو الخلوية) إلى 5.5 (يوجد عادة في الإندوسومات والليزوزومات) ، يظهر ND6 زيادة بمقدار الضعف تقريبا في التألق (الشكل 2 د) ، مما يدل على حساسية الأس الهيدروجيني. علاوة على ذلك ، تشير محاكاة الديناميات الجزيئية إلى أن ND6 يندمج بسهولة في طبقة الدهون المزدوجة مع سقالة ND التي تواجه خارج الغشاء وبقايا البيبيرازين التي تظهر تفاعلات قوية مع مجموعات رأس الفوسفوليبيد (الشكل 3). إجمالا ، تجعل هذه الميزات ND6 نظيرا مثاليا للدهون الفلورية لتصور وقياس معدل دوران الدهون الغشائية أثناء الإخراج الخلوي / التداخل الخلوي.
يقدم هذا البحث طريقة لدراسة معدل دوران وديناميكيات الدهون SV باستخدام الخلايا العصبية الحصين للفأر المستزرعة. من خلال تحفيز الخلايا العصبية باستخدام محاليل K + Tyrode العالية ، تم تحميل SVs وغشاء البلازما ب ND6 (الشكل 4A ، B). بعد ذلك ، تم إعادة تحفيز الخلايا العصبية بمحفزات مختلفة تليها محاليل التيرود المحتوية على NH4Cl و pH 5.5 (الشكل 4D). يسهل هذا البروتوكول القياس الكمي لمعدلات الإخراج الخلوي والخلوي المجمعة في ظل ظروف مختلفة (الشكل 4C).
Protocol
Representative Results
Discussion
منذ فترة طويلة تستخدم الأصباغ القائمة على الدهون ، مثل 1،1′-dioctadecyl-3،3،3′،3′-tetramethylindocarbocyanine (DiI) و 3،3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO) ، لتوضيح مورفولوجيا الخلية وتتبع العمليات الخلوية مثل الإسقاطات المحورية للخلايا العصبية. تم اختراع أصباغ الستيريل ، مثل FM1-43 ، واستخدامها بنجاح لدراسة الإخراج<sup cl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل منحة مكتب جامعة فلوريدا أتلانتيك للأبحاث والاستفسار الجامعي (M.J.S.) ، ومنحة وزارة الصحة في فلوريدا Ed and Ethel Moore Pilot Grant 20A17 (QZ) ، ومنحة جمعية الزهايمر AARG-NTF-19-618710 (QZ) ، ومنحة NIA R21 AG061656-01A1 (Q.Z.).
Materials
| Digidata 1440A Data Acquistion System | Molecular Devices | Digidata 1440A | For synchronized stimulation and solution exchange |
| Dual Channel Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | For live-cell imaging |
| Fetal Bovine Serum | OMEGA Scientific | FB-01 | For making H+20 solution used in dissection and tissue culture |
| Hamamatsu Flash4.0 sCOMS camera | Hamamatsu Inc. | C13440-20CU | high-sensitivity camera |
| Hank's Balanced Salt Solution | Sigma | H6648 | For making H+20 solution used in dissection and tissue culture |
| Heated Platform | Warner Instruments | PH-1 | For live-cell imaging |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | For tissue culture |
| Micro-G Vibration Isolation Table | TMC | 63-564 | For live-cell imaging |
| Micro-manager | https://micro-manager.org/ | NA | For image acquisition control |
| Multi-Line In-Line Solution Heater | Warner Instruments | SHM-6 | For live-cell imaging |
| Neurobasal Plus Medium | THermoFisher Scientific | A3582901 | For tissue culture |
| Nikon Ti-E Inverted Microscope | Nikon | Ti-E/B | For live-cell imaging |
| ORCA-Flash4.0 Digital CMOS camera | Hamamatsu | C1340-20CU | For live-cell imaging |
| Perfusion Chamber | Warner Instruments | RC-26G | For live-cell imaging |
| Six-Channel Valve Control Perfusion System | Warner Instruments | VC-6 | For solution exchange |
| Square Pulse Stimulator | Grass Instrument | SD9 | For electric field stimulation |
References
- Polo, S., Pece, S., Di Fiore, P. P. Endocytosis and cancer. Current Opinion in Cell Biology. 16 (2), 156-161 (2004).
- Eckert, G. P., Wood, W. G., Muller, W. E. Lipid membranes and beta-amyloid: a harmful connection. Current Protein and Pept Science. 11 (5), 319-325 (2010).
- Augustine, G. J., Burns, M. E., DeBello, W. M., Pettit, D. L., Schweizer, F. E. Exocytosis: proteins and perturbations. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 36, 659-701 (1996).
- Ammar, M. R., Kassas, N., Chasserot-Golaz, S., Bader, M. F., Vitale, N. Lipids in regulated exocytosis: what are they doing. Frontiers in Endocrinology. 4, 125 (2013).
- Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C. Membrane fusion. Cell. 112 (4), 519-533 (2003).
- Chabanon, M., Stachowiak, J. C., Rangamani, P. Systems biology of cellular membranes: a convergence with biophysics. Wiley Interdisciplinary Reviews. Systems Biology and Medicine. 9 (5), 1386 (2017).
- Prosser, D. C., Wrasman, K., Woodard, T. K., O’Donnell, A. F., Wendland, B. Applications of pHluorin for quantitative, kinetic and high-throughput analysis of endocytosis in budding yeast. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54587 (2016).
- Burrone, J., Li, Z., Murthy, V. N. Studying vesicle cycling in presynaptic terminals using the genetically encoded probe synaptopHluorin. Nature Protocols. 1 (6), 2970-2978 (2006).
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Chan, Y. -. H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
- Demchenko, A. P., Mély, Y., Duportail, G., Klymchenko, A. S. Monitoring biophysical properties of lipid membranes by environment-sensitive fluorescent probes. Biophysical Journal. 96 (9), 3461-3470 (2009).
- Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle recycling by staining and destaining vesicles with FM dyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (1), 77-83 (2012).
- Gaus, K., Zech, T., Harder, T. Visualizing membrane microdomains by Laurdan 2-photon microscopy. Molecular Membrane Biology. 23 (1), 41-48 (2006).
- Kahms, M., Klingauf, J. Novel pH-sensitive lipid based exo-endocytosis tracers reveal fast intermixing of synaptic vesicle pools. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 18 (2018).
- Zhou, L., Xie, L., Liu, C., Xiao, Y. New trends of molecular probes based on the fluorophore 4-amino-1,8-naphthalimide. Chinese Chemical Letters. 30 (10), 1799-1808 (2019).
- Tomczyk, M. D., Walczak, K. Z. l,8-Naphthalimide based DNA intercalators and anticancer agents. A systematic review from 2007 to 2017. European Journal of Medicinal Chemistry. 159, 393-422 (2018).
- Ulla, H., et al. Blue emitting 1,8-naphthalimides with electron transport properties for organic light emitting diode applications. Journal of Molecular Structure. 1143 (5), 344-354 (2017).
- Duke, R. M., Veale, E. B., Pfeffer, F. M., Kruger, P. E., Gunnlaugsson, T. Colorimetric and fluorescent anion sensors: An overview of recent developments in the use of 1,8-naphthalimide-based chemosensors. Chemical Society Reviews. 39 (10), 3936-3953 (2010).
- Panja, S. K., Dwivedi, N., Saha, S. Tuning the intramolecular charge transfer (ICT) process in push-pull systems: Effect of nitro groups. RSC Advances. 6 (107), 105786-105794 (2016).
- Thomas, D., et al. Solvatochromic and pH-sensitive fluorescent membrane probes for imaging of live cells. ACS Chemical Neuroscience. 12 (4), 719-734 (2021).
- Leslie, K. G., Jacquemin, D., New, E. J., Jolliffe, K. A. Expanding the breadth of 4-amino-1,8-naphthalimide photophysical properties through substitution of the naphthalimide core. Chemistry – A European Journal. 24 (21), 5569-5573 (2018).
- Liu, G. S., Tsien, R. W. Properties of synaptic transmission at single hippocampal synaptic boutons. Nature. 375 (6530), 404-408 (1995).
- Zhang, Q., Cao, Y. -. Q., Tsien, R. W. Quantum dots provide an optical signal specific to full collapse fusion of synaptic vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 104 (45), 17843-17848 (2007).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
- Sudhof, T. C. The synaptic vesicle cycle. Annual Review of Neuroscience. 27, 509-547 (2004).
- Lazarenko, R. M., DelBove, C. E., Strothman, C. E., Zhang, Q. Ammonium chloride alters neuronal excitability and synaptic vesicle release. Scientific Reports. 7 (1), 5061 (2017).
- Wilhelm, B. G., et al. Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins. Science. 344 (6187), 1023-1028 (2014).
- Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools. Nature Reviews. Neuroscience. 6 (1), 57-69 (2005).
- DelBove, C. E., et al. Reciprocal modulation between amyloid precursor protein and synaptic membrane cholesterol revealed by live cell imaging. Neurobiology of Disease. 127, 449-461 (2019).
- Dason, J. S., Smith, A. J., Marin, L., Charlton, M. P. Vesicular sterols are essential for synaptic vesicle cycling. Journal of Neuroscience. 30 (47), 15856-15865 (2010).
- Chanaday, N. L., Cousin, M. A., Milosevic, I., Watanabe, S., Morgan, J. R. The synaptic vesicle cycle revisited: New insights into the modes and mechanisms. Journal of Neuroscience. 39 (42), 8209-8216 (2019).
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200 (1992).
- Afuwape, O. A., Kavalali, E. T. Imaging synaptic vesicle exocytosis-endocytosis with pH-sensitive fluorescent proteins. Methods in Molecular Biology. 1474, 187-200 (2016).
