pH 感受性蛍光脂質アナログ ND6 による膜脂質代謝回転の測定(英語)

脂質二重層は、最も一般的な生体分子集合体の1つであり、すべての細胞に不可欠です。細胞の外では、細胞とその環境を接する原形質膜を形成します。細胞内では、指定された機能に特化したさまざまな細胞小器官を区画化します。脂質膜は、静止しているというよりはむしろ動的であり、常に融合と分裂を経験し、生体材料の輸送、オルガネラの改革、形態の変化、および細胞間コミュニケーションを媒介します。脂質膜は、ほとんどすべての細胞プロセスの物理的基盤であり、その機能不全は、がん¹からアルツハイマー病²に至るまでのさまざまな疾患において重要な役割を果たしています。脂質分子はタンパク質に比べて多様性がはるかに低いですが、これまでの膜研究は主にタンパク質中心でした。例えば、エキソサイトーシスにおける脂質よりもタンパク質機構について多くのことが知られている^3,4,5。さらに、表面および細胞内膜における脂質の組織化、分布、動態、および恒常性は、膜タンパク質と比較してほとんど未解明のままです⁶。

突然変異誘発などの最新の分子生物学技術は、脂質ではなくタンパク質を研究するための方法論的利点を提供するため、これは驚くべきことではありません。例えば、pH感受性緑色蛍光タンパク質(別名pHluorin)を小胞タンパク質にトランスジェニックタグ付けすると、エキソ/エンドサイトーシス中の小胞タンパク質の代謝回転量と速度の定量的測定が容易になります^7,8,9。しかし、生体内で膜脂質を遺伝子改変することはほとんど不可能です。さらに、タンパク質の量と分布の定性的および定量的操作は、脂質の操作よりもはるかに実行可能です¹⁰。それにもかかわらず、天然および合成の蛍光脂質が単離され、in vitroおよびin vivoで内因性膜脂質をシミュレートするために開発されています¹¹。広く使用されている蛍光脂質の1つのグループは、膜増強蛍光を示し、ニューロンにおけるシナプス小胞(SV)放出を研究するための強力なツールであるFM1-43などのスチリル色素です¹²。近年、環境感受性脂質色素が発明され、膜電位¹¹、相順序¹³、分泌¹⁴など、さまざまな細胞膜特性を研究するための新しいクラスのレポーターとして広く使用されています。

蛍光がpH感受性(例:pHluorin)と膜感受性(例:FM1-43)の両方を持つ新しいクラスの脂質模倣物が開発され、細胞膜およびエンドソーム/リソソーム内の脂質分布と、エキソ/エンドサイトーシス中の脂質交通を直接測定しました。この目的のために、分子内電荷移動によるプッシュプル特性を示すよく知られたソルバトクロミック蛍光色素を選択しました。既存のソルバトクロミック蛍光色素の中で、1,8-ナフタルイミド(ND)スキャフォールドは比較的簡単に改変でき、タグ付けに汎用性があり、光物理学ではユニークであり¹⁵、したがってDNAインターカレーター、有機発光ダイオード、および生体分子^{センサー16,17,18}に使用されています。

ND足場のC4位に電子供与基を付着させると、プッシュプル構造が生成され、励起状態での電子密度が再分配されることで双極子モーメントが増加する^19,20。このような分子内電荷移動は、大きな量子収率とストークスシフトを生成し、明るく安定した蛍光をもたらす²¹。このグループは最近、ND足場に基づく一連のソルバトクロミック脂質類似体を開発し、良好な合成収率でそれらを得ました²⁰。

分光特性評価により、これらの生成物の中でND6は最高の蛍光特性を有することが示されています(図1)²⁰。まず、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、GFPなどの一般的な蛍光色素と比較して、励起ピークと発光ピークが十分に分離されているため( 図2A、Bではそれぞれ~400 nmと~520 nm)、スペクトル的に分離できるため、マルチカラーイメージングに有用です。第二に、ND6蛍光はミセル存在下で8倍以上の蛍光を示し(図2C)、強い膜依存性を示唆しています。異なる種類の細胞を用いた以前の生細胞蛍光イメージング研究では、ND6²⁰による優れた膜染色が示されました。第3に、溶液のpHを7.5(細胞外または細胞質環境で一般的に見られる)から5.5(エンドソームおよびリソソームで一般的に見られる)に下げると、ND6の蛍光が約2倍に増加し(図2D)、pH感受性を示します。さらに、分子動力学シミュレーションでは、ND6は脂質二重層に容易に組み込まれ、ND足場は膜の外側を向いており、ピペラジン残基はリン脂質ヘッド基と強い相互作用を示しています(図3)。これらの特徴により、ND6は、エキソ/エンドサイトーシス中の膜脂質代謝回転を可視化および測定するための理想的な蛍光脂質類似体となっています。

この論文では、培養マウス海馬ニューロンを用いてSV脂質の代謝回転速度と動態を研究する方法を紹介します。高K⁺ チロード溶液でニューロンを刺激することにより、SVと原形質膜にND6をロードしました(図4A、B)。続いて、ニューロンを異なる刺激で再刺激し、NH₄Cl含有とpH 5.5のTyrode溶液で再刺激しました(図4D)。このプロトコルは、さまざまな状況下で組み立てられたエキソサイトーシスおよびエンドサイトーシス率の定量的測定を容易にします(図4C)。