מדידת תחלופת שומנים בממברנה עם ND6 אנלוגי פלואורסצנטי רגיש ל- pH
Summary
פרוטוקול זה מציג שיטת הדמיה פלואורסצנטית המשתמשת במחלקה של פלואורופורים ליפידים רגישים ל- pH כדי לעקוב אחר תנועת קרום השומנים במהלך אקסוציטוזה של התא ומחזור האנדוציטוזה.
Abstract
אקסו/אנדוציטוזה הוא תהליך נפוץ המתווך חילופי ביומולקולות בין תאים לסביבתם ובין תאים שונים. תאים מתמחים משתמשים בתהליך זה כדי לבצע תפקודי גוף חיוניים כגון הפרשת אינסולין מתאי β ושחרור מוליכים עצביים מסינפסות כימיות. בשל חשיבותו הפיזיולוגית, אקסו/אנדוציטוזה היה אחד הנושאים הנחקרים ביותר בביולוגיה של התא. כלים רבים פותחו כדי לחקור את התהליך הזה ברמת הגן והחלבון, שבגללם ידוע רבות על מנגנון החלבונים המשתתפים בתהליך זה. עם זאת, מעט מאוד שיטות פותחו כדי למדוד את תחלופת השומנים בממברנה, שהיא הבסיס הפיזי של אקסו / אנדוציטוזה.
מאמר זה מציג סוג של אנלוגים חדשים של שומנים פלואורסצנטיים המציגים פלואורסצנטיות תלוית pH ומדגים את השימוש בהם כדי לעקוב אחר מחזור שומנים בין קרום הפלזמה לבין שלפוחיות ההפרשה. בעזרת מניפולציות pH פשוטות, אנלוגים אלה מאפשרים גם לכמת את התפלגות השומנים על פני השטח ואת תאי הממברנה התאיים, כמו גם את מדידת קצב תחלופת השומנים במהלך exo-/ אנדוציטוזה. כתבי שומנים חדשים אלה יהיו בעלי עניין רב בתחומי מחקר ביולוגיים שונים כגון ביולוגיה של התא ומדעי המוח.
Introduction
דו-שכבת השומנים היא אחת ממכלולי הביומולקולות הנפוצות ביותר והיא הכרחית לכל התאים. מחוץ לתאים, הוא יוצר את תאי התממשקות קרום הפלזמה ואת סביבתם; בתוך התאים, הוא ממדר אברונים שונים המתמחים בפונקציות ייעודיות. באופן דינמי יותר מאשר דומם, קרומי השומנים חווים כל הזמן איחוי וביקוע, המתווכים את שינוע החומרים הביולוגיים, רפורמת אברונים, שינוי מורפולוגיה ותקשורת תאית. אין ספק, קרום השומנים הוא הבסיס הפיזי כמעט לכל התהליכים התאיים, ותפקוד לקוי שלו משחק תפקיד מכריע בהפרעות שונות, החל מסרטן1 ועד מחלת אלצהיימר2. למרות שמולקולות שומנים הן הרבה פחות מגוונות מחלבונים, מחקר הממברנות עד כה היה בעיקר ממוקד חלבון. לדוגמה, הרבה יותר ידוע על מכונות חלבון מאשר על שומנים באקסוציטוזה 3,4,5. יתר על כן, הארגון, הפיזור, הדינמיקה וההומאוסטזיס של ליפידים על פני השטח ועל פני השטח של הממברנות התוך-תאיות נותרו במידה רבה בלתי נחקרים בהשוואה לחלבוני ממברנה6.
זה לא מפתיע מכיוון שטכניקות מודרניות של ביולוגיה מולקולרית, כגון מוטגנזה, מספקות יתרון מתודולוגי לחקר חלבונים ולא ליפידים. לדוגמה, תיוג מהונדס של חלבון פלואורסצנטי ירוק רגיש ל- pH רגיש ל- pHluorin לחלבוני שלפוחית מאפשר מדידה כמותית של כמות וקצב תחלופת חלבון שלפוחית במהלך exo-/אנדוציטוזה 7,8,9. עם זאת, זה כמעט בלתי אפשרי לשנות גנטית שומנים בקרום in vivo. יתר על כן, מניפולציות איכותיות ואפילו כמותיות של כמויות חלבון והתפלגויות הם הרבה יותר ריאלי מאלה של שומנים10. עם זאת, שומנים פלואורסצנטיים מקומיים וסינתטיים בודדו ופותחו כדי לדמות שומנים אנדוגניים בממברנה במבחנה ו-in vivo11. קבוצה אחת של שומנים פלואורסצנטיים בשימוש נרחב הם צבעי סטיריל, למשל FM1-43, המציגים פלואורסצנטיות משופרת בקרום ומהווים כלי רב עוצמה בחקר שחרור שלפוחית סינפטית (SV) בתאי עצב12. לאחרונה, צבעי שומנים רגישים לסביבה הומצאו ונעשה בהם שימוש נרחב כסוג חדש של כתבים לחקר תכונות שונות של קרום התא, כולל פוטנציאל קרום11, סדר שלב13 והפרשת14.
סוג חדש של מימטי שומנים שהפלואורסצנטיות שלהם רגישה גם ל-pH (למשל, pHluorin) וגם לקרום (למשל, FM1-43) פותחה כדי למדוד ישירות את התפלגות השומנים בקרום הפלזמה ובאנדוזומים/ליזוזומים ואת תנועת השומנים במהלך אקסו/אנדוציטוזה. הפלואורופורים הסולבטוכרומיים הידועים בעלי תכונות דחיפה-משיכה עקב העברת מטען תוך-מולקולרית נבחרו למטרה זו. מבין הפלואורופורים הסולבטוכרומיים הקיימים, פיגום 1,8-נפתלימיד (ND) קל יחסית לשינוי, רב-תכליתי לתיוג, והוא ייחודי בפוטו-פיזיקה15 ולכן שימש באינטרקלטורים של דנ”א, דיודות פולטות אור אורגניות וחיישני ביומולקולות 16,17,18.
הצמדת קבוצה תורמת אלקטרונים למיקום C4 של פיגום ND יוצרת מבנה דחיפה-משיכה, המוביל למומנט דיפול מוגבר על ידי חלוקה מחדש של צפיפות האלקטרונים במצב מעורר19,20. העברת מטען תוך-מולקולרית כזו מייצרת תפוקות קוונטיות גדולות ותזוזות סטוקס, והתוצאה היא פלואורסצנטיות בהירה ויציבה21. קבוצה זו פיתחה לאחרונה סדרה של אנלוגים שומנים solvatochromic המבוססים על פיגום ND והשיגה אותם עם תשואות סינתטיות טובות20.
אפיון ספקטרוסקופי מראה שבין המוצרים האלה, ND6 הוא בעל התכונות הפלואורסצנטיות הטובות ביותר (איור 1)20. ראשית, יש לו שיאי עירור ופליטה מופרדים היטב (כלומר, ~400 ננומטר ו~520 ננומטר, בהתאמה, באיור 2A,B) בהשוואה לפלואורופורים פופולריים כמו פלואורסצאין איזותיוציאנט, רודמין או GFP, מה שהופך אותו לניתן להפרדה ספקטרלית מהם ולכן שימושי להדמיה מרובת צבעים. שנית, פלואורסצנטיות ND6 מציגה עלייה של יותר מפי שמונה בפלואורסצנטיות שלה בנוכחות מיצלות (איור 2C), מה שמרמז על תלות חזקה בקרום. מחקרי הדמיה פלואורסצנטיים קודמים של תאים חיים עם סוגים שונים של תאים הראו צביעת קרום מעולה על ידי ND620. שלישית, כאשר רמת החומציות של התמיסה יורדת מ-7.5 (נמצא בדרך כלל בסביבות חוץ-תאיות או ציטוסוליות) ל-5.5 (נמצא בדרך כלל באנדוזומים וליזוזומים), ND6 מראה עלייה של בערך פי 2 בפלואורסצנטיות (איור 2D), מה שמראה את רגישות ה-pH שלה. יתר על כן, סימולציה של דינמיקה מולקולרית מצביעה על כך ש-ND6 משתלב בקלות בדו-שכבה השומנית כאשר פיגום ה-ND שלו פונה החוצה מהממברנה ושאריות פיפרזין ומראה אינטראקציות חזקות עם קבוצות ראשי פוספוליפידים (איור 3). בסך הכל, תכונות אלה הופכות את ND6 לאנלוגי שומנים פלואורסצנטי אידיאלי כדי להמחיש ולמדוד את תחלופת השומנים בקרום במהלך אקסו/אנדוציטוזה.
מאמר זה מציג שיטה לחקר קצב התחלופה והדינמיקה של שומנים SV באמצעות תאי עצב בהיפוקמפוס של עכבר בתרבית. על-ידי גירוי תאי עצב עם תמיסות K+ Tyrode גבוהות, SVs וקרום הפלזמה הועמסו ב-ND6 (איור 4A,B). לאחר מכן, תאי עצב עוררו מחדש עם גירויים שונים, ואחריהם תמיסות של NH4Cl ו-pH 5.5 Tyrode (איור 4D). פרוטוקול זה מאפשר מדידה כמותית של שיעורי האקסוציטוזה והאנדוציטוזה המורכבים בנסיבות שונות (איור 4C).
Protocol
Representative Results
Discussion
צבעים מבוססי ליפידים, כגון 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine (DiI) ו- 3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO), שימשו זה מכבר להמחשת מורפולוגיה של תאים ולמעקב אחר תהליכים תאיים כגון תחזיות אקסונים של נוירונים. צבעי סטיריל, כגון FM1-43, הומצאו ושימשו בהצלחה לחקר אקסוציטוזה34. בשל הזיקה הנמוכה שלה?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי משרד המחקר והחקירה לתואר ראשון של אוניברסיטת פלורידה אטלנטיק (M.J.S.), מענק פיילוט של מחלקת הבריאות של פלורידה אד ואתל מור 20A17 (Q.Z.), מענק איגוד האלצהיימר AARG-NTF-19-618710 (Q.Z.), ומענק NIA R21 AG061656-01A1 (Q.Z).
Materials
| Digidata 1440A Data Acquistion System | Molecular Devices | Digidata 1440A | For synchronized stimulation and solution exchange |
| Dual Channel Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | For live-cell imaging |
| Fetal Bovine Serum | OMEGA Scientific | FB-01 | For making H+20 solution used in dissection and tissue culture |
| Hamamatsu Flash4.0 sCOMS camera | Hamamatsu Inc. | C13440-20CU | high-sensitivity camera |
| Hank's Balanced Salt Solution | Sigma | H6648 | For making H+20 solution used in dissection and tissue culture |
| Heated Platform | Warner Instruments | PH-1 | For live-cell imaging |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | For tissue culture |
| Micro-G Vibration Isolation Table | TMC | 63-564 | For live-cell imaging |
| Micro-manager | https://micro-manager.org/ | NA | For image acquisition control |
| Multi-Line In-Line Solution Heater | Warner Instruments | SHM-6 | For live-cell imaging |
| Neurobasal Plus Medium | THermoFisher Scientific | A3582901 | For tissue culture |
| Nikon Ti-E Inverted Microscope | Nikon | Ti-E/B | For live-cell imaging |
| ORCA-Flash4.0 Digital CMOS camera | Hamamatsu | C1340-20CU | For live-cell imaging |
| Perfusion Chamber | Warner Instruments | RC-26G | For live-cell imaging |
| Six-Channel Valve Control Perfusion System | Warner Instruments | VC-6 | For solution exchange |
| Square Pulse Stimulator | Grass Instrument | SD9 | For electric field stimulation |
References
- Polo, S., Pece, S., Di Fiore, P. P. Endocytosis and cancer. Current Opinion in Cell Biology. 16 (2), 156-161 (2004).
- Eckert, G. P., Wood, W. G., Muller, W. E. Lipid membranes and beta-amyloid: a harmful connection. Current Protein and Pept Science. 11 (5), 319-325 (2010).
- Augustine, G. J., Burns, M. E., DeBello, W. M., Pettit, D. L., Schweizer, F. E. Exocytosis: proteins and perturbations. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 36, 659-701 (1996).
- Ammar, M. R., Kassas, N., Chasserot-Golaz, S., Bader, M. F., Vitale, N. Lipids in regulated exocytosis: what are they doing. Frontiers in Endocrinology. 4, 125 (2013).
- Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C. Membrane fusion. Cell. 112 (4), 519-533 (2003).
- Chabanon, M., Stachowiak, J. C., Rangamani, P. Systems biology of cellular membranes: a convergence with biophysics. Wiley Interdisciplinary Reviews. Systems Biology and Medicine. 9 (5), 1386 (2017).
- Prosser, D. C., Wrasman, K., Woodard, T. K., O’Donnell, A. F., Wendland, B. Applications of pHluorin for quantitative, kinetic and high-throughput analysis of endocytosis in budding yeast. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54587 (2016).
- Burrone, J., Li, Z., Murthy, V. N. Studying vesicle cycling in presynaptic terminals using the genetically encoded probe synaptopHluorin. Nature Protocols. 1 (6), 2970-2978 (2006).
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Chan, Y. -. H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
- Demchenko, A. P., Mély, Y., Duportail, G., Klymchenko, A. S. Monitoring biophysical properties of lipid membranes by environment-sensitive fluorescent probes. Biophysical Journal. 96 (9), 3461-3470 (2009).
- Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle recycling by staining and destaining vesicles with FM dyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (1), 77-83 (2012).
- Gaus, K., Zech, T., Harder, T. Visualizing membrane microdomains by Laurdan 2-photon microscopy. Molecular Membrane Biology. 23 (1), 41-48 (2006).
- Kahms, M., Klingauf, J. Novel pH-sensitive lipid based exo-endocytosis tracers reveal fast intermixing of synaptic vesicle pools. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 18 (2018).
- Zhou, L., Xie, L., Liu, C., Xiao, Y. New trends of molecular probes based on the fluorophore 4-amino-1,8-naphthalimide. Chinese Chemical Letters. 30 (10), 1799-1808 (2019).
- Tomczyk, M. D., Walczak, K. Z. l,8-Naphthalimide based DNA intercalators and anticancer agents. A systematic review from 2007 to 2017. European Journal of Medicinal Chemistry. 159, 393-422 (2018).
- Ulla, H., et al. Blue emitting 1,8-naphthalimides with electron transport properties for organic light emitting diode applications. Journal of Molecular Structure. 1143 (5), 344-354 (2017).
- Duke, R. M., Veale, E. B., Pfeffer, F. M., Kruger, P. E., Gunnlaugsson, T. Colorimetric and fluorescent anion sensors: An overview of recent developments in the use of 1,8-naphthalimide-based chemosensors. Chemical Society Reviews. 39 (10), 3936-3953 (2010).
- Panja, S. K., Dwivedi, N., Saha, S. Tuning the intramolecular charge transfer (ICT) process in push-pull systems: Effect of nitro groups. RSC Advances. 6 (107), 105786-105794 (2016).
- Thomas, D., et al. Solvatochromic and pH-sensitive fluorescent membrane probes for imaging of live cells. ACS Chemical Neuroscience. 12 (4), 719-734 (2021).
- Leslie, K. G., Jacquemin, D., New, E. J., Jolliffe, K. A. Expanding the breadth of 4-amino-1,8-naphthalimide photophysical properties through substitution of the naphthalimide core. Chemistry – A European Journal. 24 (21), 5569-5573 (2018).
- Liu, G. S., Tsien, R. W. Properties of synaptic transmission at single hippocampal synaptic boutons. Nature. 375 (6530), 404-408 (1995).
- Zhang, Q., Cao, Y. -. Q., Tsien, R. W. Quantum dots provide an optical signal specific to full collapse fusion of synaptic vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 104 (45), 17843-17848 (2007).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
- Sudhof, T. C. The synaptic vesicle cycle. Annual Review of Neuroscience. 27, 509-547 (2004).
- Lazarenko, R. M., DelBove, C. E., Strothman, C. E., Zhang, Q. Ammonium chloride alters neuronal excitability and synaptic vesicle release. Scientific Reports. 7 (1), 5061 (2017).
- Wilhelm, B. G., et al. Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins. Science. 344 (6187), 1023-1028 (2014).
- Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools. Nature Reviews. Neuroscience. 6 (1), 57-69 (2005).
- DelBove, C. E., et al. Reciprocal modulation between amyloid precursor protein and synaptic membrane cholesterol revealed by live cell imaging. Neurobiology of Disease. 127, 449-461 (2019).
- Dason, J. S., Smith, A. J., Marin, L., Charlton, M. P. Vesicular sterols are essential for synaptic vesicle cycling. Journal of Neuroscience. 30 (47), 15856-15865 (2010).
- Chanaday, N. L., Cousin, M. A., Milosevic, I., Watanabe, S., Morgan, J. R. The synaptic vesicle cycle revisited: New insights into the modes and mechanisms. Journal of Neuroscience. 39 (42), 8209-8216 (2019).
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200 (1992).
- Afuwape, O. A., Kavalali, E. T. Imaging synaptic vesicle exocytosis-endocytosis with pH-sensitive fluorescent proteins. Methods in Molecular Biology. 1474, 187-200 (2016).
