Medición del recambio de lípidos de membrana con el análogo lipídico fluorescente sensible al pH ND6

La bicapa lipídica es uno de los ensamblajes de biomoléculas más comunes y es indispensable para todas las células. Fuera de las células, forma la membrana plasmática que interconecta las células y su entorno; Dentro de las células, compartimenta varios orgánulos especializados para funcionalidades designadas. Más dinámicas que quietas, las membranas lipídicas experimentan constantemente fusión y fisión, lo que media el transporte de biomateriales, la reforma de orgánulos, el cambio morfológico y la comunicación celular. Sin duda, la membrana lipídica es la base física de casi todos los procesos celulares, y su disfunción juega un papel crucial en diversos trastornos que van desde el cáncer¹ hasta la enfermedad de Alzheimer². Aunque las moléculas lipídicas son mucho menos diversas que las proteínas, la investigación de membranas hasta ahora se ha centrado principalmente en las proteínas. Por ejemplo, se sabe mucho más sobre la maquinaria proteica que sobre los lípidos en la exocitosis ^3,4,5. Además, la organización, distribución, dinámica y homeostasis de los lípidos a través de las membranas superficiales e intracelulares permanecen en gran medida inexploradas en comparación con las proteínas de membrana⁶.

Esto no es sorprendente, ya que las técnicas modernas de biología molecular, como la mutagénesis, proporcionan una ventaja metodológica para estudiar proteínas en lugar de lípidos. Por ejemplo, el marcaje transgénico de la proteína verde fluorescente sensible al pH (también conocida como pHluorina) a las proteínas vesiculares facilita la medición cuantitativa de la cantidad y la tasa de recambio de proteínas vesiculares durante la exocitosis/endocitosis ^7,8,9. Sin embargo, es casi imposible modificar genéticamente los lípidos de membrana in vivo. Además, las manipulaciones cualitativas e incluso cuantitativas de las cantidades y distribuciones de proteínas son mucho más factibles que las de los lípidos¹⁰. Sin embargo, se han aislado y desarrollado lípidos fluorescentes nativos y sintéticos para simular lípidos de membrana endógena in vitro e in vivo¹¹. Un grupo de lípidos fluorescentes ampliamente utilizados son los colorantes de estirilo, por ejemplo, FM1-43, que exhiben fluorescencia mejorada por membrana y son una herramienta poderosa en el estudio de la liberación de vesículas sinápticas (SV) en las neuronas¹². Últimamente, los colorantes lipídicos sensibles al medio ambiente se han inventado y se han utilizado ampliamente como una nueva clase de reporteros para estudiar varias propiedades de la membrana celular, incluido el potencial de membrana¹¹, el orden de fase¹³ y la secreción¹⁴.

Se desarrolló una nueva clase de miméticos lipídicos cuya fluorescencia es sensible al pH (p. ej., pHluorin) y a la membrana (p. ej., FM1-43) para medir directamente la distribución de lípidos en la membrana plasmática y los endosomas/lisosomas y el tráfico de lípidos durante la exocitosis/endocitosis. Para ello, se seleccionaron los conocidos fluoróforos solvatocrómicos que presentan características push-pull debido a la transferencia de carga intramolecular. Entre los fluoróforos solvatocrómicos existentes, el andamio de 1,8-naftalimida (ND) es relativamente fácil de modificar, versátil para el etiquetado y es único en fotofísica¹⁵ y, por lo tanto, se ha utilizado en intercaladores de ADN, diodos emisores de luz orgánicos y sensores de biomoléculas 16,17,18.

La unión de un grupo donante de electrones a la posición C4 del andamio ND genera una estructura push-pull, que conduce a un aumento del momento dipolar mediante la redistribución de la densidad de electrones en el estado excitado^19,20. Tal transferencia de carga intramolecular produce grandes rendimientos cuánticos y desplazamientos de Stokes, lo que resulta en una fluorescencia brillante y estable²¹. Este grupo ha desarrollado recientemente una serie de análogos lipídicos solvatocrómicos basados en el andamio ND y los ha obtenido con buenos rendimientos sintéticos²⁰.

La caracterización espectroscópica muestra que, entre esos productos, el ND6 posee las mejores propiedades de fluorescencia (Figura 1)²⁰. En primer lugar, tiene picos de excitación y emisión bien separados (es decir, ~400 nm y ~520 nm, respectivamente, en la Figura 2A, B) en comparación con los fluoróforos populares como el isotiocianato de fluoresceína, la rodamina o la GFP, lo que lo hace espectralmente separable de ellos y, por lo tanto, útil para la obtención de imágenes multicolor. En segundo lugar, la fluorescencia de ND6 exhibe un aumento de más de ocho veces en su fluorescencia en presencia de micelas (Figura 2C), lo que sugiere una fuerte dependencia de la membrana. Estudios previos de imágenes de fluorescencia de células vivas con diferentes tipos de células mostraron una excelente tinción de membrana por ND6²⁰. En tercer lugar, cuando el pH de la solución disminuye de 7,5 (que se encuentra comúnmente en ambientes extracelulares o citosólicos) a 5,5 (que se encuentra comúnmente en endosomas y lisosomas), ND6 muestra un aumento de aproximadamente el doble en la fluorescencia (Figura 2D), lo que muestra su sensibilidad al pH. Además, la simulación de dinámica molecular indica que ND6 se integra fácilmente en la bicapa lipídica con su andamio ND hacia afuera de la membrana y el residuo de piperazina muestra fuertes interacciones con los grupos principales de fosfolípidos (Figura 3). En conjunto, estas características hacen de ND6 un análogo lipídico fluorescente ideal para visualizar y medir el recambio lipídico de la membrana durante la exocitosis/endocitosis.

En este artículo se presenta un método para estudiar la tasa de recambio y la dinámica de los lípidos SV utilizando neuronas del hipocampo de ratón cultivadas. Al estimular las neuronas con soluciones de Tyrode con alto contenido de K⁺ , los SV y la membrana plasmática se cargaron con ND6 (Figura 4A, B). Posteriormente, las neuronas fueron reestimuladas con diferentes estímulos seguidos de soluciones de Tyrode que contienen NH₄Cl y pH 5,5 (Figura 4D). Este protocolo facilita la medición cuantitativa de las tasas de exocitosis y endocitosis ensambladas en diferentes circunstancias (Figura 4C).