Messung des Membranlipidumsatzes mit dem pH-empfindlichen Fluoreszenz-Lipid-Analogon ND6

Die Lipiddoppelschicht ist eine der häufigsten Biomolekül-Anordnungen und für alle Zellen unverzichtbar. Außerhalb der Zellen bildet es die Plasmamembran, die Zellen und ihre Umgebung miteinander verbindet; In Zellen unterteilt es verschiedene Organellen, die auf bestimmte Funktionalitäten spezialisiert sind. Lipidmembranen sind eher dynamisch als still und erfahren ständig Fusion und Spaltung, die den Transport von Biomaterial, die Organellenreform, die Morphologieänderung und die zelluläre Kommunikation vermittelt. Zweifellos ist die Lipidmembran die physikalische Grundlage für fast alle zellulären Prozesse, und ihre Funktionsstörung spielt eine entscheidende Rolle bei verschiedenen Erkrankungen von Krebs¹ bis Alzheimer². Obwohl Lipidmoleküle weit weniger vielfältig sind als Proteine, war die Membranforschung bisher hauptsächlich proteinzentriert. Zum Beispiel ist viel mehr über die Proteinmaschinerie als über Lipide in der Exozytose^{bekannt 3,4,5}. Darüber hinaus sind die Organisation, Verteilung, Dynamik und Homöostase von Lipiden über Oberflächen- und intrazelluläre Membranen im Vergleich zu Membranproteinen weitgehend unerforscht⁶.

Dies ist nicht verwunderlich, da moderne molekularbiologische Techniken wie die Mutagenese einen methodischen Vorteil für die Untersuchung von Proteinen anstelle von Lipiden bieten. Beispielsweise erleichtert die transgene Markierung von pH-empfindlichem grün fluoreszierendem Protein (auch bekannt als pHluorin) an vesikuläre Proteine die quantitative Messung der Menge und Geschwindigkeit des vesikulären Proteinumsatzes während der Exo-/Endozytose ^7,8,9. Es ist jedoch fast unmöglich, Membranlipide in vivo genetisch zu verändern. Darüber hinaus sind qualitative und sogar quantitative Manipulationen von Proteinmengen und -verteilungen viel praktikabler als die von Lipiden¹⁰. Dennoch wurden native und synthetische fluoreszierende Lipide isoliert und entwickelt, um endogene Membranlipide in vitro und in vivo zu simulieren ¹¹. Eine Gruppe weit verbreiteter fluoreszierender Lipide sind Styrylfarbstoffe, z. B. FM1-43, die membranverstärkte Fluoreszenz aufweisen und ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der Freisetzung synaptischer Vesikel (SV) in Neuronen sind¹². In letzter Zeit wurden umweltempfindliche Lipidfarbstoffe erfunden und als neue Klasse von Reportern verwendet, um verschiedene Zellmembraneigenschaften zu untersuchen, einschließlich Membranpotential¹¹, Phasenordnung¹³ und Sekretion¹⁴.

Eine neue Klasse von Lipidmimetika, deren Fluoreszenz sowohl pH-sensitiv (z.B. pHluorin) als auch membransensitiv (z.B. FM1-43) ist, wurde entwickelt, um die Lipidverteilung in der Plasmamembran und den Endosomen/Lysosomen sowie den Lipidverkehr während der Exo-/Endozytose direkt zu messen. Zu diesem Zweck wurden die bekannten solvatochromen Fluorophore ausgewählt, die aufgrund des intramolekularen Ladungstransfers Push-Pull-Eigenschaften aufweisen. Unter den bestehenden solvatochromen Fluorophoren ist das 1,8-Naphthalimid (ND)-Gerüst relativ leicht zu modifizieren, vielseitig für die Markierung und einzigartig in der Photophysik¹⁵ und wurde daher in DNA-Interkalatoren, organischen Leuchtdioden und Biomolekülsensoren verwendet 16,17,18.

Durch das Anbringen einer elektronenabgebenden Gruppe an der C4-Position des ND-Gerüsts wird eine Push-Pull-Struktur erzeugt, die durch Umverteilung der Elektronendichte im angeregten Zustand^19,20 zu einem erhöhten Dipolmoment führt. Ein solcher intramolekularer Ladungstransfer erzeugt große Quantenausbeuten und Stokes-Verschiebungen, was zu einer hellen und stabilen Fluoreszenz^{führt 21}. Diese Gruppe hat kürzlich eine Reihe von solvatochromen Lipidanaloga auf der Grundlage des ND-Gerüsts entwickelt und sie mit guten synthetischen Ausbeuten^{erhalten 20}.

Die spektroskopische Charakterisierung zeigt, dass ND6 unter diesen Produkten die besten Fluoreszenzeigenschaften besitzt (Abbildung 1)²⁰. Erstens hat es im Vergleich zu gängigen Fluorophoren wie Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin oder GFP gut getrennte Anregungs- und Emissionspeaks (d. h. ~400 nm bzw. ~520 nm in Abbildung 2A, B), wodurch es spektral von ihnen getrennt werden kann und daher für die mehrfarbige Bildgebung nützlich ist. Zweitens weist die ND6-Fluoreszenz in Gegenwart von Mizellen einen mehr als achtfachen Anstieg ihrer Fluoreszenz auf (Abbildung 2C), was auf eine starke Membranabhängigkeit hindeutet. Frühere Fluoreszenz-Bildgebungsstudien mit verschiedenen Zelltypen zeigten eine hervorragende Membranfärbung durch ND6²⁰. Drittens, wenn der pH-Wert der Lösung von 7,5 (häufig in extrazellulären oder zytosolischen Umgebungen zu finden) auf 5,5 (häufig in Endosomen und Lysosomen zu finden) gesenkt wird, zeigt ND6 einen etwa zweifachen Anstieg der Fluoreszenz (Abbildung 2D), was seine pH-Empfindlichkeit zeigt. Darüber hinaus zeigt die Molekulardynamik-Simulation, dass sich ND6 leicht in die Lipiddoppelschicht integriert, wobei sein ND-Gerüst aus der Membran und dem Piperazinrest herausragt und starke Wechselwirkungen mit Phospholipidkopfgruppen zeigt (Abbildung 3). Insgesamt machen diese Eigenschaften ND6 zu einem idealen fluoreszierenden Lipidanalogon zur Visualisierung und Messung des Membranlipidumsatzes während der Exo-/Endozytose.

In dieser Arbeit wird eine Methode zur Untersuchung der Umsatzrate und Dynamik von SV-Lipiden unter Verwendung kultivierter Maus-Hippocampus-Neuronen vorgestellt. Durch die Stimulation von Neuronen mit hohen K⁺-Tyrode-Lösungen wurden SVs und die Plasmamembran mit ND6 beladen (Abbildung 4A,B). Anschließend wurden die Neuronen mit verschiedenen Stimuli restimuliert, gefolgt von NH₄Cl-haltigen und pH 5,5 Tyrode-Lösungen (Abbildung 4D). Dieses Protokoll erleichtert die quantitative Messung der zusammengestellten Exozytose- und Endozytoseraten unter verschiedenen Umständen (Abbildung 4C).