Mesure du renouvellement lipidique membranaire avec l’analogue lipidique fluorescent ND6 sensible au pH

La bicouche lipidique est l’un des assemblages de biomolécules les plus courants et est indispensable à toutes les cellules. À l’extérieur des cellules, il forme la membrane plasmique qui interface les cellules et leur environnement ; À l’intérieur des cellules, il compartimente divers organites spécialisés pour des fonctionnalités désignées. Plutôt dynamiques qu’immobiles, les membranes lipidiques subissent constamment une fusion et une fission, qui interviennent dans le transport des biomatériaux, la réforme des organites, le changement morphologique et la communication cellulaire. Sans aucun doute, la membrane lipidique est la base physique de presque tous les processus cellulaires, et son dysfonctionnement joue un rôle crucial dans divers troubles allant du cancer¹ à la maladie d’Alzheimer². Bien que les molécules lipidiques soient beaucoup moins diversifiées que les protéines, la recherche sur les membranes a jusqu’à présent été principalement centrée sur les protéines. Par exemple, on en sait beaucoup plus sur la machinerie protéique que sur les lipides dans l’exocytose ^3,4,5. De plus, l’organisation, la distribution, la dynamique et l’homéostasie des lipides à travers les membranes de surface et intracellulaires restent largement inexplorées par rapport aux protéines membranaires⁶.

Ce n’est pas surprenant car les techniques modernes de biologie moléculaire, telles que la mutagénèse, offrent un avantage méthodologique pour étudier les protéines plutôt que les lipides. Par exemple, le marquage transgénique de la protéine fluorescente verte sensible au pH (pHluorine) sur les protéines vésiculaires facilite la mesure quantitative de la quantité et du taux de renouvellement des protéines vésiculaires au cours de l’exocytose^et de l’endocytose ^7,8,9. Cependant, il est presque impossible de modifier génétiquement les lipides membranaires in vivo. De plus, les manipulations qualitatives et même quantitatives des quantités et des distributions de protéines sont beaucoup plus réalisables que celles des lipides¹⁰. Néanmoins, des lipides fluorescents natifs et synthétiques ont été isolés et développés pour simuler des lipides membranaires endogènes in vitro et in vivo¹¹. Un groupe de lipides fluorescents largement utilisés sont les colorants styryliques, par exemple FM1-43, qui présentent une fluorescence membranaire améliorée et constituent un outil puissant dans l’étude de la libération de vésicules synaptiques (SV) dans les neurones¹². Dernièrement, des colorants lipidiques sensibles à l’environnement ont été inventés et largement utilisés comme nouvelle classe de rapporteurs pour étudier diverses propriétés de la membrane cellulaire, notamment le potentiel de membrane¹¹, l’ordre de phase¹³ et la sécrétion¹⁴.

Une nouvelle classe de mimétiques lipidiques dont la fluorescence est à la fois sensible au pH (p. ex., pHluorin) et à la membrane (p. ex., FM1-43) a été mise au point pour mesurer directement la distribution des lipides dans la membrane plasmique et les endosomes/lysosomes et le trafic lipidique pendant l’exo-/endocytose. Les fluorophores solvatochromiques bien connus présentant des caractéristiques push-pull dues au transfert de charge intramoléculaire ont été sélectionnés à cette fin. Parmi les fluorophores solvatochromes existants, l’échafaudage de 1,8-naphtalimide (ND) est relativement facile à modifier, polyvalent pour le marquage, et est unique en photophysique¹⁵ et a donc été utilisé dans les intercalateurs d’ADN, les diodes électroluminescentes organiques et les capteurs de biomolécules 16,17,18.

L’attachement d’un groupe donneur d’électrons à la position C4 de l’échafaudage ND génère une structure push-pull, qui conduit à une augmentation du moment dipolaire en redistribuant la densité électronique dans l’état excité^19,20. Un tel transfert de charge intramoléculaire produit de grands rendements quantiques et des décalages de Stokes, ce qui donne une fluorescence brillante et stable²¹. Ce groupe a récemment développé une série d’analogues lipidiques solvatochromes basés sur l’échafaudage ND et les a obtenus avec de bons rendements synthétiques²⁰.

La caractérisation spectroscopique montre que parmi ces produits, ND6 possède les meilleures propriétés de fluorescence (Figure 1)²⁰. Tout d’abord, il a des pics d’excitation et d’émission bien séparés (c’est-à-dire ~400 nm et ~520 nm, respectivement, dans la figure 2A,B) par rapport aux fluorophores populaires tels que l’isothiocyanate de fluorescéine, la rhodamine ou la GFP, ce qui le rend spectrement séparable d’eux et donc utile pour l’imagerie multicolore. Deuxièmement, la fluorescence ND6 présente une augmentation de plus de huit fois de sa fluorescence en présence de micelles (Figure 2C), suggérant une forte dépendance membranaire. Des études antérieures d’imagerie par fluorescence de cellules vivantes avec différents types de cellules ont montré une excellente coloration membranaire par ND6²⁰. Troisièmement, lorsque le pH de la solution est réduit de 7,5 (couramment trouvé dans les environnements extracellulaires ou cytosoliques) à 5,5 (couramment trouvé dans les endosomes et les lysosomes), ND6 montre une augmentation d’environ deux fois de la fluorescence (Figure 2D), montrant sa sensibilité au pH. De plus, la simulation de dynamique moléculaire indique que ND6 s’intègre facilement dans la bicouche lipidique avec son échafaudage ND tourné vers l’extérieur de la membrane et le résidu de pipérazine montrant de fortes interactions avec les groupes de tête phospholipidiques (Figure 3). Ensemble, ces caractéristiques font de ND6 un analogue lipidique fluorescent idéal pour visualiser et mesurer le renouvellement lipidique membranaire pendant l’exo-/endocytose.

Cet article présente une méthode pour étudier le taux de renouvellement et la dynamique des lipides SV à l’aide de neurones hippocampiques de souris en culture. En stimulant les neurones avec des solutions de Tyrode à haute teneur en K⁺, les SV et la membrane plasmique ont été chargés en ND6 (Figure 4A,B). Par la suite, les neurones ont été restimulés avec différents stimuli suivis de solutions contenant du NH₄Cl et du pH 5,5 de Tyrode (Figure 4D). Ce protocole facilite la mesure quantitative des taux d’exocytose et d’endocytose assemblés dans différentes circonstances (Figure 4C).