Uso De Las Neuronas Del Hipocampo Cultivadas Primarias Para Estudiar El Ensamblaje De Los Segmentos Iniciales Axón
Summary
Aquí, se describe un protocolo para estudiar cuantitativamente el montaje y la estructura de los segmentos iniciales de axones (AIS) de las neuronas del hipocampo que carecen de AIS pre-montado debido a la ausencia de una anquiria gigante-G.
Abstract
Los segmentos iniciales de axones neuronales (AIS) son sitios de iniciación de potenciales de acción y han sido ampliamente estudiados por su estructura molecular, ensamblaje y plasticidad dependiente de la actividad. Ankyrin-G gigante, el organizador principal de AIS, asocia directamente con el voltaje membrana-que atraviesa el sodio bloqueado (VSVG) y los canales del potasio (KCNQ2/3), así como el neurofascin 186 del kDa, una molécula de la adherencia de célula de L1CAM. Ankyrin-G gigante también ata a y recluta las moléculas citoplásmicas de AIS incluyendo beta-4-spectrin, y las proteínas microtubule-obligatoria, EB1/EB3 y Ndel1. Ankyrin-G gigante es suficiente rescatar la formación de AIS en neuronas deficientes de ankyrin-G. Ankyrin-G también incluye una isoforma más pequeña de 190 kDa situada en las espinas dendríticas en vez del AIS, que es incapaz de apuntar al AIS o de rescatar el AIS en neuronas ankyrin-G-deficientes. Aquí, se describe un protocolo utilizando neuronas del hipocampo cultivadas de ANK3-E22/23-flox ratones, que, cuando se transfecta con Cre-BFP exhiben la pérdida de toda la isoforma de la anquirina-G y deteriorar la formación de AIS. Combinado un sistema modificado de glía de Banker / neurona co-cultivo, hemos desarrollado un método para transfectar ankyrin-G neuronas nulas con un 480 kDa ankyrin-G-GFP plásmido, que es suficiente para rescatar la formación de AIS. Además, empleamos un método de cuantificación, desarrollado por Salzer y sus colegas para hacer frente a la variación en la distancia AIS de los cuerpos celulares neuronales que se produce en los cultivos de neuronas del hipocampo. Este protocolo permite realizar estudios cuantitativos del ensamblaje de novo y del comportamiento dinámico del AIS.
Introduction
El segmento inicial del axón se encuentra en el axón proximal en la mayoría de las neuronas vertebradas. Funcionalmente, AIS es donde se inician los potenciales de acción debido a la alta densidad de canales de sodio bloqueados por voltaje en esta región. Los AIS de algunas neuronas excitatorias también son atacados por interneuronas inhibitorias a través de la formación de sinapsis GABAérgicas1,2,3. Por lo tanto, AIS es un sitio crítico para integrar la señalización celular y modular la excitabilidad de las neuronas. AIS es normalmente 20-60 μm de longitud y situado dentro de 20 μm del cuerpo celular. La longitud y posición de AIS varía en las neuronas a través de las regiones del cerebro, así como en diferentes etapas de desarrollo de la misma neurona4,5. La evidencia acumulada sugiere que la composición y la posición del SIA son dinámicas en respuesta al cambio de la actividad neuronal4,5,6,7.
480 kDa ankyrin-G es el organizador maestro de AIS. 480 kDa ankyrin-G es una proteína adaptadora asociada a la membrana que se une directamente a los canales de sodio bloqueados por voltaje, así como a otras proteínas AIS importantes, incluidos los canales beta4-spectrin, KCNQ2/3 que modulan la actividad del canal de sodio8,9,y 186 kDa neurofascin, un L1CAM que dirige las sinapsis GABAérgicas al AIS2,10. 480 kDa ankyrin-G comparte dominios canónicos de ankyrin encontrados en la isoforma corta de ankyrin-G de 190 kDa (repeticiones DE ANK, dominio de unión a spectrin, dominio regulador), pero se distinguen por un exón gigante que se encuentra solo en vertebrados y se expresa específicamente en neuronas(Figura 1A)11,12. El dominio específico de la neurona ankyrin-G de 480 kDa (NSD) se requiere para la formación de AIS12. La ankyrin-G de 190 kDa no promueve el ensamblaje de AIS ni se dirige a AIS en neuronas ankyrin-G-null12. Sin embargo, 190 kDa ankyrin-G se concentra en el AIS que contiene 480 kDa ankyrin-G12. Esta capacidad de la anquirina-G de 190 kDa para apuntar a AIS premontado de neuronas de tipo salvaje ha sido una fuente de confusión en la literatura y ha ralentizado la apreciación de las funciones especializadas críticas de la anquirina-G de 480 kDa en el ensamblaje de AIS. Por lo tanto, es fundamental estudiar el ensamblaje de AIS en neuronas ankyrin-G-null que carecen de un AIS preensamblado.
Aquí, presentamos un método para estudiar el ensamblaje y la estructura del AIS utilizando neuronas hippocampales cultivadas de ratones ANK3-E22/23-flox que elimina todas las isoformas de ankyrin-G13 (Figura 1B). Transfectando neuronas con una construcción Cre-BFP antes de que se ensase el AIS, generamos neuronas deficientes en anquirina-G que carecían completamente de un AIS(Figura 1B, Figura 2). El ensamblaje de AIS se rescata completamente después de la co-transfección del plásmido de anquirina-G-GFP de 480 kDa con un plásmido Cre-BFP. Este método proporciona una manera de estudiar el ensamblado AIS en un entorno AIS no premontado. También modificamos el sistema de co-cultivo de glía-neurona de Gary Banker sin usar antibióticos, previamente diseñado para neuronas embrionarias de día 18, para su aplicación a neuronas de ratón postnatales y adaptamos un método de cuantificación AIS a las mediciones promedio de AIS de múltiples neuronas para normalizar la variación de AIS14,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
El montaje de AIS está organizado por 480 kDa ankyrin-G. Sin embargo, la anquirona-G tiene isoformas más cortas que pueden apuntar al AIS de las neuronas de tipo salvaje, lo que puede conducir a la dificultad en la interpretación de los análisis de estructura-función del ensamblaje de AIS. Aquí presentamos un método utilizando neuronas de ratones ANK3-E22/23-flox que permite el estudio del ensamblaje de novo del AIS. Al transfectar con Cre-BFP a 3 div, eliminamos todas las isoformas endógenas d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. Gary Banker por su sugerencia sobre el protocolo de cultivo neuronal. Este trabajo cuenta con el apoyo del Instituto Médico Howard Hughes, una subvención de los NIH y una cátedra (V.B.
Materials
| 10xHBSS | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| 18mm coverglass (1.5D) | Fisher Scientific | 12-545-84-1D | |
| 190kDa ankyrin-G-GFP | Addgene | #31059 | |
| 2.5% Tripsin without phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| 480kDa ankyrin-G-GFP | lab made | Provide upon request | |
| ANK3-E22/23f/f mice | JAX | Stock No: 029797 | B6.129-Ank3tm2.1Bnt/J; |
| B27 serum-free supplement | Thermo Fisher Scientific | A3582801 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Cell strainer with 70-mm mesh | BD Biosciences | 352350 | |
| Ceramic coverslip-staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| Cre-BFP | Addgene | #128174 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995073 | |
| GlutaMAX-I supplement | Thermo Fisher Scientific | A1286001 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668030 | |
| MEM with Earle’s salts and L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | |
| Nitric acid 70% | Sigma-Aldrich | 225711 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Poly-L-lysine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 26124-78-7 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 |
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