主培養海馬ニューロンを用いた軸索初期セグメントの組み立て研究
Summary
ここでは、巨大なアンキリンGがないために組み立て済みのAISを欠く海馬ニューロンの軸索初期セグメント(AIS)の組み立てと構造を定量的に研究するプロトコルについて説明した。
Abstract
ニューロン軸索初期セグメント(AIS)は、作用電位の開始部位であり、分子構造、組立および活動依存性の可塑性について広く研究されている。AISのマスターオーガナイザーであるジャイアントアンキリンGは、膜をまたぐ電圧ゲート付きナトリウム(VSVG)およびカリウムチャネル(KCNQ2/3)、ならびにL1CAM細胞接着分子である186kDaニューロファシンと直接関連付けます。ジャイアントアンキリン-Gはまた、β-4-スペクトリン、および微小管結合タンパク質EB1/EB3およびNdel1を含む細胞質AIS分子に結合し、募集する。巨大なアンキリンGは、アンキリンG欠損ニューロンにおけるAIS形成を救うのに十分である。Ankyrin-Gはまた、AISの代わりに樹状脊椎に位置する小さな190 kDaアイソフォームを含み、AISに標的化したり、アンキリンG欠損ニューロンでAISを救出することができない。ここでは、ANK3-E22/23-floxマウスからの培養海馬ニューロンを用いたプロトコルについて説明し、Cre-BFPにトランスフェクトすると、アンキリンGのすべてのアイソフォームの喪失を示し、AISの形成を損なう。修飾されたバンカーグリア/ニューロン共培養システムを組み合わせて、AISの形成を救うのに十分な480 kDaアンキリンG-GFPプラスミドを持つアンキリンGヌルニューロンをトランスフェクトする方法を開発しました。さらに、サルザーと同僚が開発した定量方法を採用し、海馬ニューロン培養で起こるニューロン細胞体からのAIS距離の変動に対処する。このプロトコルは、AISのデノボアセンブリと動的挙動の定量的研究を可能にする。
Introduction
軸索初期セグメントは、ほとんどの脊椎動物ニューロンの近位軸索に位置する。機能的には、AISは、この領域の電圧ゲートナトリウムチャネルの高密度のためにアクション電位が開始される場所です。いくつかの興奮性ニューロンのAISはまた、GABAergicシナプス1、2、3を形成することによって阻害性インターニューロンによって標的にされる。したがって、AISは細胞シグナル伝達を統合し、ニューロンの興奮性を調節する重要な部位である。AISは通常20~60μmの長さで、細胞体から20μm以内に位置しています。AIS の長さと位置は、脳領域全体のニューロンで異なります, 同様に同じニューロンの異なる発達段階で 4,5.蓄積された証拠は、AISの組成と位置が神経活動4、5、6、7の変化に応答するに動的であることを示唆した。
480 kDaアンキリンGはAISのマスターオーガナイザーです。480 kDa ankyrin-G は、電圧ゲート付きナトリウムチャネルに直接結合する膜関連アダプタタンパク質であり、β4-spectrin、KCNQ2/3 チャネルを含む他の主要な AIS タンパク質に直接結合し、ナトリウムチャネル活性8、9、および 186 kDa ニューロファスシンをAIS10に誘導する L1CAM である。480 kDa ankyrin-Gは、短い190kDaアンキリンGアイソフォーム(ANK反復、スペクトリン結合ドメイン、調節ドメイン)に見られる正規アンキリンドメインを共有するが、脊椎動物にのみ見られ、特にニューロンで発現している巨大なエキソンによって区別される(図1A)11、12。AIS形成12には、480kDaアンキリン-Gニューロン特異的ドメイン(NSD)が必要である。190 kDa ankyrin-G は、AIS アセンブリを促進したり、アンキリン-G-ヌルニューロン12で AIS を標的としたりしません。しかし、190kDaアンキリン-Gは480kDaアンキリン-G12を含むAISに集中している。野生型ニューロンの組み立てられたAISを標的とする190 kDa ankyrin-Gのこの能力は、文献の混乱の原因であり、AISアセンブリにおける480 kDa ankyrin-Gの重要な特殊機能の評価を遅らせてきた。したがって、組み立て済みのAISを欠いているankyrin-G-nullニューロンでAISアセンブリを研究することが重要です。
ここでは、ANK3-E22/23-floxマウスの培養海馬ニューロンを用いてAISの組み立てと構造を研究する方法を提示し、アンキリン-G13のアイソフォームをすべて排除する(図1B)。 AISが組み立てられる前にCre-BFP構造を持つニューロンをトランスフェクトすることによって、AISを完全に欠けているアンキリンG欠損ニューロンを生成した(図1B、図2)。AISのアセンブリは、クレBFPプラスミドを用いた480kDaアンキリン-G-GFPプラスミドの共同トランスフェクションに続いて完全に救出される。この方法は、事前にアセンブルされていない AIS 環境で AIS アセンブリを調査する方法を提供します。我々はまた、出生後マウスニューロンに適用するために、以前は胚性18ニューロンのために設計された抗生物質を使用せずにゲイリー・バンカーからグリアニューロン共培養システムを改変し、AIS14,15の変動を正常化するために複数のニューロンからのAIS測定を平均化するAIS定量法を適応した。
Protocol
Representative Results
Discussion
AISの組み立ては480 kDaアンキリン-Gによって組織される。しかし、ankyrin-Gは野生型ニューロンのAISを標的とすることができる短いアイソフォームを有し、AISアセンブリの構造機能解析の解釈が困難になる可能性がある。ここでは、AISのデノボアセンブリの研究を可能にするANK3-E22/23-floxマウスのニューロンを用いた方法を提示する。 3 divでCre-BFPでトランスフェクトすることにより?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
神経培養プロトコルに関する提案をしてくれたゲイリー・バンカー博士に感謝します。この研究は、ハワード・ヒューズ医学研究所、NIHからの助成金、ジョージ・バース・ゲラーが教授職(V.B.)によって支えられている。
Materials
| 10xHBSS | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| 18mm coverglass (1.5D) | Fisher Scientific | 12-545-84-1D | |
| 190kDa ankyrin-G-GFP | Addgene | #31059 | |
| 2.5% Tripsin without phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| 480kDa ankyrin-G-GFP | lab made | Provide upon request | |
| ANK3-E22/23f/f mice | JAX | Stock No: 029797 | B6.129-Ank3tm2.1Bnt/J; |
| B27 serum-free supplement | Thermo Fisher Scientific | A3582801 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Cell strainer with 70-mm mesh | BD Biosciences | 352350 | |
| Ceramic coverslip-staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| Cre-BFP | Addgene | #128174 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995073 | |
| GlutaMAX-I supplement | Thermo Fisher Scientific | A1286001 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668030 | |
| MEM with Earle’s salts and L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | |
| Nitric acid 70% | Sigma-Aldrich | 225711 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Poly-L-lysine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 26124-78-7 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 |
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