استخدام الخلايا العصبية فرس النهر المستزرعة الأولية لدراسة تجميع الأجزاء الأولية أكسون
Summary
هنا، وصفنا بروتوكول لدراسة كميا تجميع وهيكل الأجزاء الأولية محور عصبي (AIS) من الخلايا العصبية فرس النهر التي تفتقر إلى AIS تجميعها مسبقا بسبب عدم وجود عملاقة أنكيرين-G.
Abstract
الأجزاء الأولية المحورية العصبية (AIS) هي مواقع لبدء إمكانات العمل وقد تمت دراستها على نطاق واسع لهيكلها الجزيئي وتجميعها ولدونتها المعتمدة على النشاط. العملاقة ankyrin-G، المنظم الرئيسي لل AIS، يرتبط مباشرة مع غشاء تمتد الجهد الصوديوم مسور (VSVG) وقنوات البوتاسيوم (KCNQ2/3)، فضلا عن 186 kDa neurofascin، جزيء الالتصاق الخلية L1CAM. العملاقة ankyrin-G يربط أيضا إلى ويجند جزيئات AIS السيتوبلازمية بما في ذلك بيتا-4-سبيكترين, والبروتينات microtubule ملزمة, EB1/EB3 و Ndel1. العملاقة ankyrin-G كافية لانقاذ تشكيل AIS في الخلايا العصبية نقص ankyrin-G. Ankyrin-G يشمل أيضا أصغر 190 kDa isoform تقع في العمود الفقري dendritic بدلا من AIS, التي هي غير قادرة على استهداف AIS أو إنقاذ AIS في الخلايا العصبية أنكيرين-G-ناقصة. هنا، وصفنا بروتوكول باستخدام الخلايا العصبية فرس النهر المستزرعة من ANK3-E22/23-flox الفئران، والتي، عندما transfected مع فقدان المعرض Cre-BFP من جميع isoform من الأنكيرين-G وإضعاف تشكيل AIS. الجمع بين تعديل بانكر غليا / الخلايا العصبية نظام الثقافة المشتركة، وضعنا طريقة لtransfect ankyrin-G الخلايا العصبية فارغة مع 480 kDa ankyrin-G-GFP البلازميد، وهو ما يكفي لإنقاذ تشكيل AIS. نحن نستخدم أيضا طريقة القياس الكمي، التي وضعتها سالزر وزملاؤه للتعامل مع الاختلاف في مسافة AIS من أجسام الخلايا العصبية التي تحدث في ثقافات الخلايا العصبية فرس النهر. يسمح هذا البروتوكول بإجراء دراسات كمية لتجميع دي نوفو والسلوك الديناميكي ل AIS.
Introduction
يقع الجزء الأولي من المحور عند المحور القريب في معظم الخلايا العصبية الفقارية. من الناحية الوظيفية ، AIS هو المكان الذي يتم فيه بدء إمكانات العمل بسبب الكثافة العالية لقنوات الصوديوم ذات بوابات الجهد في هذه المنطقة. AIS من بعض الخلايا العصبية مثيرة وتستهدف أيضا من قبل interneurons المثبطة من خلال تشكيل نقاط الاشتباك العصبي GABAergic1,2,3. لذلك ، AIS هو موقع حاسم لدمج إشارات الخلايا وتعديل استثارة الخلايا العصبية. AIS هو عادة 20-60 ميكرومتر في الطول وتقع ضمن 20 ميكرومتر من جسم الخلية. طول وموقف AIS يختلف في الخلايا العصبية عبر مناطق الدماغ, وكذلك في مراحل النمو المختلفة من نفس الخلايا العصبية4,5. وتشير الأدلة المتراكمة إلى أن تكوين وموقع AIS ديناميكية في الاستجابة لتغير نشاط الخلايا العصبية4و5و6و7.
480 kDa ankyrin-G هو المنظم الرئيسي ل AIS. 480 kDa ankyrin-G هو بروتين محول مرتبط بالغشاء يرتبط مباشرة بقنوات الصوديوم المسورة بالجهد وكذلك بروتينات AIS الرئيسية الأخرى بما في ذلك beta4-spectrin و KCNQ2/3 القنوات التي تعدل نشاط قناة الصوديوم8و9و 186 kDa neurofascin ، وهو L1CAM يوجه نقاط الاشتباك العصبي GABAergic إلى AIS2،10. 480 kDa ankyrin-G أسهم المجالات الكنسي ankyrin وجدت في قصيرة 190 kDa ankyrin-G isoform (ANK يكرر, المجال ملزمة spectrin, المجال التنظيمي), ولكن تتميز exon العملاقة التي توجد فقط في الفقاريات ويتم التعبير عنها على وجه التحديد في الخلايا العصبية (الشكل 1A)11,12. ال 480 kDa ankyrin-G مجال الخلايا العصبية محددة (NSD) مطلوب لتشكيل AIS12. و190 kDa ankyrin-G لا يعزز AIS التجمع أو الهدف AIS في الخلايا العصبية ankyrin-G-null12. ومع ذلك، 190 كدا ankyrin-G يتركز في AIS تحتوي على 480 kDa ankyrin-G12. هذه القدرة من 190 kDa ankyrin-G لاستهداف AIS تجميعها مسبقا من الخلايا العصبية البرية كان مصدرا للارتباك في الأدب وأبطأت تقدير الوظائف المتخصصة الحرجة من 480 kDa ankyrin-G في جمعية AIS. لذلك، فمن الأهمية بمكان لدراسة الجمعية AIS في الخلايا العصبية ankyrin-G-null التي تفتقر إلى AIS تجميعها مسبقا.
هنا، نقدم طريقة لدراسة تجميع وهيكل AIS باستخدام الخلايا العصبية فرس النهر المستزرعة من ANK3-E22/23-flox الفئران التي تقضي على جميع isoforms من ankyrin-G13 (الشكل 1B). عن طريق تحويل الخلايا العصبية مع بناء Cre-BFP قبل أن يتم تجميع AIS، قمنا بتوليد الخلايا العصبية ankyrin-G-ناقص تفتقر تماما إلى AIS (الشكل 1B، الشكل 2). يتم إنقاذ تجميع AIS بالكامل بعد المشاركة في إعادة العدوى من 480 kDa ankyrin-G-GFP plasmid مع بلازميد Cre-BFP. يوفر هذا الأسلوب طريقة لدراسة تجميع AIS في بيئة AIS غير تجميعها مسبقا. كما قمنا بتعديل نظام الثقافة المشتركة بين الخلايا العصبية من غاري بانكر دون استخدام المضادات الحيوية ، المصممة سابقا للخلايا العصبية الجنينية في اليوم 18 ، لتطبيقها على الخلايا العصبية الماوس بعد الولادة وتكييفها طريقة كمية AIS لمتوسط قياسات AIS من الخلايا العصبية المتعددة لتطبيع الاختلاف من AIS14،15.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتم تنظيم جمعية AIS من قبل 480 kDa ankyrin-G. ومع ذلك، أنكيرين-G لديه isoforms أقصر التي يمكن أن تستهدف AIS من الخلايا العصبية البرية، والتي قد تؤدي إلى صعوبة في تفسير تحليلات هيكل وظيفة التجمع AIS. هنا نقدم طريقة باستخدام الخلايا العصبية من ANK3-E22/23-flox الفئران التي تسمح لدراسة الجمعية دي نوفو من AIS. ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور غاري بانكر على اقتراحه بشأن بروتوكول ثقافة الخلايا العصبية. ويدعم هذا العمل معهد هوارد هيوز الطبي، وهو منحة من المعاهد القومية للصحة، وهبت جورج بارث جيلر الأستاذية (V.B.
Materials
| 10xHBSS | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| 18mm coverglass (1.5D) | Fisher Scientific | 12-545-84-1D | |
| 190kDa ankyrin-G-GFP | Addgene | #31059 | |
| 2.5% Tripsin without phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| 480kDa ankyrin-G-GFP | lab made | Provide upon request | |
| ANK3-E22/23f/f mice | JAX | Stock No: 029797 | B6.129-Ank3tm2.1Bnt/J; |
| B27 serum-free supplement | Thermo Fisher Scientific | A3582801 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Cell strainer with 70-mm mesh | BD Biosciences | 352350 | |
| Ceramic coverslip-staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| Cre-BFP | Addgene | #128174 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995073 | |
| GlutaMAX-I supplement | Thermo Fisher Scientific | A1286001 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668030 | |
| MEM with Earle’s salts and L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | |
| Nitric acid 70% | Sigma-Aldrich | 225711 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Poly-L-lysine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 26124-78-7 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 |
References
- Nelson, A. D., et al. Correction: Ankyrin-G regulates forebrain connectivity and network synchronization via interaction with GABARAP. Molecular Psychiatry. , (2019).
- Tseng, W. C., Jenkins, P. M., Tanaka, M., Mooney, R., Bennett, V. Giant ankyrin-G stabilizes somatodendritic GABAergic synapses through opposing endocytosis of GABAA receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 1214-1219 (2015).
- Tai, Y., Gallo, N. B., Wang, M., Yu, J. R., Van Aelst, L. Axo-axonic Innervation of Neocortical Pyramidal Neurons by GABAergic Chandelier Cells Requires AnkyrinG-Associated L1CAM. Neuron. 102 (2), 358-372 (2019).
- Hofflin, F., et al. Heterogeneity of the Axon Initial Segment in Interneurons and Pyramidal Cells of Rodent Visual Cortex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 332 (2017).
- Schluter, A., et al. Structural Plasticity of Synaptopodin in the Axon Initial Segment during Visual Cortex Development. Cerebral Cortex. 27 (9), 4662-4675 (2017).
- Kuba, H., Oichi, Y., Ohmori, H. Presynaptic activity regulates Na(+) channel distribution at the axon initial segment. Nature. 465 (7301), 1075-1078 (2010).
- Grubb, M. S., Burrone, J. Activity-dependent relocation of the axon initial segment fine-tunes neuronal excitability. Nature. 465 (7301), 1070-1074 (2010).
- Pan, Z., et al. A common ankyrin-G-based mechanism retains KCNQ and NaV channels at electrically active domains of the axon. Journal of Neuroscience. 26 (10), 2599-2613 (2006).
- Cooper, E. C. Made for “anchorin”: Kv7.2/7.3 (KCNQ2/KCNQ3) channels and the modulation of neuronal excitability in vertebrate axons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (2), 185-192 (2011).
- Zhou, D., et al. AnkyrinG is required for clustering of voltage-gated Na channels at axon initial segments and for normal action potential firing. The Journal of Cell Biology. 143 (5), 1295-1304 (1998).
- Kordeli, E., Lambert, S., Bennett, V. AnkyrinG. A new ankyrin gene with neural-specific isoforms localized at the axonal initial segment and node of Ranvier. Journal of Biological Chemistry. 270 (5), 2352-2359 (1995).
- Jenkins, P. M., et al. Giant ankyrin-G: a critical innovation in vertebrate evolution of fast and integrated neuronal signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 957-964 (2015).
- Jenkins, P. M., et al. E-cadherin polarity is determined by a multifunction motif mediating lateral membrane retention through ankyrin-G and apical-lateral transcytosis through clathrin. Journal of Biological Chemistry. 288 (20), 14018-14031 (2013).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocol. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Berger, S. L., et al. Localized Myosin II Activity Regulates Assembly and Plasticity of the Axon Initial Segment. Neuron. 97 (3), 555-570 (2018).
- Yang, R., et al. Neurodevelopmental mutation of giant ankyrin-G disrupts a core mechanism for axon initial segment assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 116 (39), 19717-19726 (2019).
