Axon İlk Segmentlerinin Montajını İncelemek için Birincil Kültürlü Hipokampal Nöronların Kullanımı
Summary
Burada, dev bir ankyrin-G’nin yokluğu nedeniyle önceden monte edilmiş AIS’den yoksun hipokampal nöronların akson başlangıç segmentlerinin (AIS) montajını ve yapısını nicel olarak incelemek için bir protokol tanımladık.
Abstract
Nöronal akson başlangıç segmentleri (AIS) eylem potansiyellerinin başlangıç alanlarıdır ve moleküler yapıları, montajları ve aktiviteye bağımlı plastisiteleri için kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. AIS’nin ana organizatörü dev ankyrin-G, membran yayılan voltaj kapılı sodyum (VSVG) ve potasyum kanalları (KCNQ2/3) ve L1CAM hücre yapışma molekülü olan 186 kDa nörofassin ile doğrudan ilişkilidir. Dev ankyrin-G ayrıca beta-4-spectrin ve mikrotübül bağlayıcı proteinler, EB1/EB3 ve Ndel1 dahil olmak üzere sitoplazmik AIS moleküllerine bağlanır ve işe alınır. Dev ankyrin-G, ankyrin-G eksik nöronlarda AIS oluşumunu kurtarmak için yeterlidir. Ankyrin-G ayrıca AIS yerine dendritik dikenlerde bulunan ve AIS’yi hedef alama veya ais’yi ankyrin-G eksikliği olan nöronlarda kurtaramayan daha küçük bir 190 kDa izoform içerir. Burada, Cre-BFP ile enfekte olduğunda tüm ankyrin-G izoformunun kaybını sergileyen ve AIS oluşumunu bozan ANK3-E22/23-flox farelerden kültürlü hipokampal nöronları kullanan bir protokol tanımladık. Modifiye banker glia/nöron ortak kültür sistemini birleştirerek, AIS oluşumunu kurtarmak için yeterli olan 480 kDa ankyrin-G-GFP plazmid ile ankyrin-G null nöronları transfect etmek için bir yöntem geliştirdik. Ayrıca, Hipokampal nöron kültürlerinde meydana gelen nöronal hücre cisimlerinden AIS uzaklığındaki varyasyonla başa çıkmak için Salzer ve meslektaşlarımız tarafından geliştirilen bir niceleme yöntemi de kullanmaktadır. Bu protokol, de novo montajının nicel çalışmalarına ve AIS’nin dinamik davranışına izin verir.
Introduction
Akson başlangıç segmenti çoğu omurgalı nöronda proksimal aksonda bulunur. İşlevsel olarak, AIS, bu bölgedeki voltaj kapılı sodyum kanallarının yüksek yoğunluğu nedeniyle eylem potansiyellerinin başlatıldığı yerdir. Bazı uyarıcı nöronların AIS’si de GABAergic sinapsları1,2,3oluşturarak inhibitör internöronlar tarafından hedeflenir. Bu nedenle, AIS hücre sinyallerini entegre etmek ve nöronların heyecanlanabilirliğini modüle etmek için kritik bir sitedir. AIS normalde 20-60 μm uzunluğundadır ve hücre gövdesinin 20 μm içinde bulunur. AIS’nin uzunluğu ve konumu beyin bölgelerindeki nöronlarda ve aynı nöronun farklı gelişim aşamalarında değişir4,5. Birikmiş kanıtlar, AIS’nin bileşiminin ve konumunun nöronal aktivitenin değişimine yanıt vermede dinamik olduğunu öne sürdü4,5,6,7.
480 kDa ankyrin-G, AIS’nin ana organizatörüdür. 480 kDa ankyrin-G, voltaj kapılı sodyum kanallarına ve beta4-spectrin dahil olmak üzere diğer büyük AIS proteinlerine doğrudan bağlanan membran ilişkili bir adaptör proteinidir, Sodyum kanal aktivitesi 8,9ve186kDa nörofascin modüle eden KCNQ2/3 kanalları, GABAergic sinapsları AIS 2,10’ayönlendiren bir L1CAM . 480 kDa ankyrin-G, kısa 190 kDa ankyrin-G izoformunda bulunan kanonik ankyrin etki alanlarını paylaşır (ANK tekrarları, spectrin bağlama etki alanı, düzenleyici alan adı), ancak sadece omurgalılarda bulunan ve özellikle nöronlarda ifade edilen dev bir ekson ile ayırt edilir (Şekil 1A)11,12. AIS oluşumu için 480 kDa ankyrin-G nöron spesifik etki alanı (NSD) gereklidir12. 190 kDa ankyrin-G, AIS montajını desteklemez veya ankyrin-G-null nöronlarda AIS’i hedeflemez12. Bununla birlikte, 190 kDa ankyrin-G, 480 kDa ankyrin-G12içeren AIS’de yoğunlaşmıştır. 190 kDa ankyrin-G’nin wildtype nöronların önceden monte edilmiş AIS’lerini hedefleme yeteneği literatürde bir karışıklık kaynağı olmuştur ve AIS montajındaki 480 kDa ankyrin-G’nin kritik özel işlevlerinin takdirini yavaşlatmıştır. Bu nedenle, önceden monte edilmiş bir AIS’den yoksun ankyrin-G-null nöronlarda AIS derlemesinin incelenmesi kritik öneme sahiptir.
Burada, ankyrin-G13’ün tüm izoformlarını ortadan kaldıran ANK3-E22/23-flox farelerden kültürlü hipokampal nöronlar kullanarak AIS’nin montajını ve yapısını incelemek için bir yöntem sunuyoruz (Şekil 1B). AIS toplanmadan önce nöronları Cre-BFP yapısı ile transfekte ederek, tamamen AIS’den yoksun ankyrin-G eksikliği olan nöronlar ürettik (Şekil 1B, Şekil 2). AIS montajı, 480 kDa ankyrin-GFP plazmidinin Cre-BFP plazmid ile birlikte transfeksiyonu sonrasında tamamen kurtarılır. Bu yöntem, önceden monte edilmemiş bir AIS ortamında AIS derlemesini incelemek için bir yol sağlar. Ayrıca, daha önce embriyonik gün 18 nöronları için tasarlanmış antibiyotik kullanmadan Gary Banker’den glia-nöron ortak kültür sistemini, doğum sonrası fare nöronlarına uygulama için değiştirdik ve AIS14,15varyasyonunu normalleştirmek için birden fazla nörondan ortalama AIS ölçümlerine bir AIS nicelasyon yöntemi uyarladık.
Protocol
Representative Results
Discussion
AIS montajı 480 kDa ankyrin-G tarafından düzenleniyor. Bununla birlikte, ankyrin-G, wildtype nöronların AIS’sine hedefleyebilen daha kısa izoformlara sahiptir ve bu da AIS montajının yapı-fonksiyon analizlerinin yorumlanmasında zorluk çekebilir. Burada, AIS’nin de novo montajının incelenmesine izin veren ANK3-E22/23-flox farelerden nöronları kullanarak bir yöntem sunuyoruz. Cre-BFP ile 3 div’de transfecting yaparak, ankyrin-G’nin tüm endojen izoformlarını ortadan kaldırırız. Ayrıc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nöronal kültür protokolü önerisi için Dr. Gary Banker’a teşekkür ederiz. Bu çalışma Howard Hughes Tıp Enstitüsü, NIH’den bir hibe ve George Barth Geller tarafından profesörlük (V.B.
Materials
| 10xHBSS | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| 18mm coverglass (1.5D) | Fisher Scientific | 12-545-84-1D | |
| 190kDa ankyrin-G-GFP | Addgene | #31059 | |
| 2.5% Tripsin without phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| 480kDa ankyrin-G-GFP | lab made | Provide upon request | |
| ANK3-E22/23f/f mice | JAX | Stock No: 029797 | B6.129-Ank3tm2.1Bnt/J; |
| B27 serum-free supplement | Thermo Fisher Scientific | A3582801 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Cell strainer with 70-mm mesh | BD Biosciences | 352350 | |
| Ceramic coverslip-staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| Cre-BFP | Addgene | #128174 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995073 | |
| GlutaMAX-I supplement | Thermo Fisher Scientific | A1286001 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668030 | |
| MEM with Earle’s salts and L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | |
| Nitric acid 70% | Sigma-Aldrich | 225711 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Poly-L-lysine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 26124-78-7 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 |
References
- Nelson, A. D., et al. Correction: Ankyrin-G regulates forebrain connectivity and network synchronization via interaction with GABARAP. Molecular Psychiatry. , (2019).
- Tseng, W. C., Jenkins, P. M., Tanaka, M., Mooney, R., Bennett, V. Giant ankyrin-G stabilizes somatodendritic GABAergic synapses through opposing endocytosis of GABAA receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 1214-1219 (2015).
- Tai, Y., Gallo, N. B., Wang, M., Yu, J. R., Van Aelst, L. Axo-axonic Innervation of Neocortical Pyramidal Neurons by GABAergic Chandelier Cells Requires AnkyrinG-Associated L1CAM. Neuron. 102 (2), 358-372 (2019).
- Hofflin, F., et al. Heterogeneity of the Axon Initial Segment in Interneurons and Pyramidal Cells of Rodent Visual Cortex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 332 (2017).
- Schluter, A., et al. Structural Plasticity of Synaptopodin in the Axon Initial Segment during Visual Cortex Development. Cerebral Cortex. 27 (9), 4662-4675 (2017).
- Kuba, H., Oichi, Y., Ohmori, H. Presynaptic activity regulates Na(+) channel distribution at the axon initial segment. Nature. 465 (7301), 1075-1078 (2010).
- Grubb, M. S., Burrone, J. Activity-dependent relocation of the axon initial segment fine-tunes neuronal excitability. Nature. 465 (7301), 1070-1074 (2010).
- Pan, Z., et al. A common ankyrin-G-based mechanism retains KCNQ and NaV channels at electrically active domains of the axon. Journal of Neuroscience. 26 (10), 2599-2613 (2006).
- Cooper, E. C. Made for “anchorin”: Kv7.2/7.3 (KCNQ2/KCNQ3) channels and the modulation of neuronal excitability in vertebrate axons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (2), 185-192 (2011).
- Zhou, D., et al. AnkyrinG is required for clustering of voltage-gated Na channels at axon initial segments and for normal action potential firing. The Journal of Cell Biology. 143 (5), 1295-1304 (1998).
- Kordeli, E., Lambert, S., Bennett, V. AnkyrinG. A new ankyrin gene with neural-specific isoforms localized at the axonal initial segment and node of Ranvier. Journal of Biological Chemistry. 270 (5), 2352-2359 (1995).
- Jenkins, P. M., et al. Giant ankyrin-G: a critical innovation in vertebrate evolution of fast and integrated neuronal signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 957-964 (2015).
- Jenkins, P. M., et al. E-cadherin polarity is determined by a multifunction motif mediating lateral membrane retention through ankyrin-G and apical-lateral transcytosis through clathrin. Journal of Biological Chemistry. 288 (20), 14018-14031 (2013).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocol. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Berger, S. L., et al. Localized Myosin II Activity Regulates Assembly and Plasticity of the Axon Initial Segment. Neuron. 97 (3), 555-570 (2018).
- Yang, R., et al. Neurodevelopmental mutation of giant ankyrin-G disrupts a core mechanism for axon initial segment assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 116 (39), 19717-19726 (2019).
