Verwendung von primär kultivierten Hippocampus-Neuronen zur Untersuchung der Anordnung von Axon-Anfangssegmenten
Summary
Hier beschrieben wir ein Protokoll zur quantitativen Untersuchung der Anordnung und Struktur der Axon-Anfangssegmente (AIS) von Hippocampus-Neuronen, denen aufgrund des Fehlens eines riesigen Ankyrin-G ein vormontiertes AIS fehlt.
Abstract
Neuronale Axon-Initialsegmente (AIS) sind Orte der Initiierung von Aktionspotentialen und wurden umfassend auf ihre molekulare Struktur, Anordnung und aktivitätsabhängige Plastizität untersucht. Giant Ankyrin-G, der Hauptorganisator von AIS, verbindet sich direkt mit membranübergreifenden spannungsgesteuerten Natrium- (VSVG) und Kaliumkanälen (KCNQ2/3) sowie 186 kDa-Neurofaszin, einem L1CAM-Zelladhäsionsmolekül. Riesen-Ankyrin-G bindet und rekrutiert auch zytoplasmatische AIS-Moleküle, einschließlich Beta-4-Spectrin und die Mikrotubuli-bindenden Proteine EB1 / EB3 und Ndel1. Riesiges Ankyrin-G reicht aus, um die AIS-Bildung in Ankyrin-G-defizienten Neuronen zu retten. Ankyrin-G enthält auch eine kleinere 190 kDa-Isoform, die sich an dendritischen Stacheln anstelle des AIS befindet, die nicht in der Lage ist, auf den AIS zu zielen oder den AIS in Ankyrin-G-defizienten Neuronen zu retten. Hier beschrieben wir ein Protokoll mit kultivierten Hippocampus-Neuronen von ANK3-E22/23-Flox-Mäusen, die, wenn sie mit Cre-BFP transfiziert werden, einen Verlust aller Isoformen von Ankyrin-G aufweisen und die Bildung von AIS beeinträchtigen. In Kombination eines modifizierten Banker-Glia/Neuron-Co-Culture-Systems entwickelten wir eine Methode, um Ankyrin-G-Nullneuronen mit einem 480 kDa Ankyrin-G-GFP-Plasmid zu transfizieren, das ausreicht, um die Bildung von AIS zu retten. Darüber hinaus verwenden wir eine quantifizierungsmethode, die von Salzer und Kollegen entwickelt wurde, um die Variation der AIS-Entfernung von den neuronalen Zellkörpern zu behandeln, die in Hippocampus-Neuronenkulturen auftritt. Dieses Protokoll ermöglicht quantitative Untersuchungen der De-novo-Assemblierung und des dynamischen Verhaltens von AIS.
Introduction
Das Axon-Anfangssegment befindet sich am proximalen Axon in den meisten Wirbeltierneuronen. Funktional ist AIS der Ort, an dem Aktionspotentiale aufgrund der hohen Dichte spannungsgesteuerter Natriumkanäle in diesem Bereich initiiert werden. AIS einiger exzitatorischer Neuronen werden auch von inhibitorischen Interneuronen durch die Bildung von GABAergen Synapsen1,2,3angegriffen. Daher ist AIS ein kritischer Ort, um Zellsignale zu integrieren und die Erregbarkeit von Neuronen zu modulieren. AIS ist normalerweise 20-60 μm lang und befindet sich innerhalb von 20 μm des Zellkörpers. Die Länge und Position von AIS variiert in Neuronen über Gehirnregionen hinweg sowie in verschiedenen Entwicklungsstadien desselben Neurons4,5. Gesammelte Beweise deuten darauf hin, dass die Zusammensetzung und Position von AIS dynamisch auf die Veränderung der neuronalen Aktivitätreagieren 4,5,6,7.
480 kDa Ankyrin-G ist der Master-Organizer von AIS. 480 kDa Ankyrin-G ist ein membranassoziiertes Adapterprotein, das direkt an spannungsgesteuerte Natriumkanäle sowie andere wichtige AIS-Proteine bindet, einschließlich Beta4-Spectrin, KCNQ2/3-Kanäle, die die Natriumkanalaktivität8,9und 186 kDa-Neurofascin modulieren, ein L1CAM, das GABAerge Synapsen zum AIS2,10leitet. 480 kDa Ankyrin-G teilt kanonische Ankyrindomänen, die in der kurzen 190 kDa Ankyrin-G-Isoform (ANK-Wiederholungen, Spectrin-Bindungsdomäne, regulatorische Domäne) gefunden werden, unterscheiden sich jedoch durch ein riesiges Exon, das nur in Wirbeltieren vorkommt und spezifisch in Neuronen exprimiert wird (Abbildung 1A)11,12. Die 480 kDa Ankyrin-G Neuronen-spezifische Domäne (NSD) wird für die AIS-Bildungbenötigt 12. Das 190 kDa Ankyrin-G fördert nicht die AIS-Assemblierung oder zielt AIS in Ankyrin-G-Null-Neuronen12. Allerdings sind 190 kDa Ankyrin-G am AIS konzentriert und enthalten 480 kDa Ankyrin-G12. Diese Fähigkeit des 190 kDa Ankyrin-G, auf vormontierte AIS von Wildtyp-Neuronen zu zielen, war eine Quelle der Verwirrung in der Literatur und hat die Wertschätzung der kritischen Spezialfunktionen des 480 kDa Ankyrin-G in der AIS-Assemblierung verlangsamt. Daher ist es wichtig, die AIS-Assemblierung in Ankyrin-G-Null-Neuronen zu untersuchen, denen ein vormontiertes AIS fehlt.
Hier stellen wir eine Methode zur Untersuchung des Aufbaus und der Struktur des AIS mit kultivierten Hippocampus-Neuronen von ANK3-E22/23-flox-Mäusen vor, die alle Isoformen von Ankyrin-G13 eliminiert (Abbildung 1B). Durch die Transfektierung von Neuronen mit einem Cre-BFP-Konstrukt, bevor AIS zusammengesetzt wird, erzeugten wir Ankyrin-G-defiziente Neuronen, die völlig ohne AIS waren (Abbildung 1B, Abbildung 2). Die Montage von AIS ist nach Co-Transfektion von 480 kDa Ankyrin-G-GFP-Plasmid mit einem Cre-BFP-Plasmid vollständig gerettet. Diese Methode bietet eine Möglichkeit, die AIS-Assembly in einer nicht vormontierten AIS-Umgebung zu untersuchen. Wir modifizierten auch das Glia-Neuron-Co-Culture-System von Gary Banker ohne Verwendung von Antibiotika, das zuvor für embryonale Neuronen am Tag 18 entwickelt wurde, für die Anwendung auf postnatale Mausneuronen und passten eine AIS-Quantifizierungsmethode an durchschnittliche AIS-Messungen von mehreren Neuronen an, um die Variation von AIS14,15zu normalisieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Montage von AIS wird von 480 kDa Ankyrin-G organisiert. Ankyrin-G hat jedoch kürzere Isoformen, die auf den AIS von Wildtyp-Neuronen abzielen können, was zu Schwierigkeiten bei der Interpretation von Struktur-Funktions-Analysen der AIS-Assemblierung führen kann. Hier stellen wir eine Methode mit Neuronen von ANK3-E22/23-flox-Mäusen vor, die es ermöglicht, die De-novo-Assemblierung des AIS zu untersuchen. Durch transfizierend mit Cre-BFP bei 3 div eliminieren wir alle endogenen Isoformen von An…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Gary Banker für den Vorschlag zum neuronalen Kulturprotokoll. Diese Arbeit wird vom Howard Hughes Medical Institute, einem Stipendium des NIH und einer George Barth Geller-Professur (V.B.) unterstützt.
Materials
| 10xHBSS | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| 18mm coverglass (1.5D) | Fisher Scientific | 12-545-84-1D | |
| 190kDa ankyrin-G-GFP | Addgene | #31059 | |
| 2.5% Tripsin without phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| 480kDa ankyrin-G-GFP | lab made | Provide upon request | |
| ANK3-E22/23f/f mice | JAX | Stock No: 029797 | B6.129-Ank3tm2.1Bnt/J; |
| B27 serum-free supplement | Thermo Fisher Scientific | A3582801 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Cell strainer with 70-mm mesh | BD Biosciences | 352350 | |
| Ceramic coverslip-staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| Cre-BFP | Addgene | #128174 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995073 | |
| GlutaMAX-I supplement | Thermo Fisher Scientific | A1286001 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668030 | |
| MEM with Earle’s salts and L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | |
| Nitric acid 70% | Sigma-Aldrich | 225711 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Poly-L-lysine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 26124-78-7 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 |
References
- Nelson, A. D., et al. Correction: Ankyrin-G regulates forebrain connectivity and network synchronization via interaction with GABARAP. Molecular Psychiatry. , (2019).
- Tseng, W. C., Jenkins, P. M., Tanaka, M., Mooney, R., Bennett, V. Giant ankyrin-G stabilizes somatodendritic GABAergic synapses through opposing endocytosis of GABAA receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 1214-1219 (2015).
- Tai, Y., Gallo, N. B., Wang, M., Yu, J. R., Van Aelst, L. Axo-axonic Innervation of Neocortical Pyramidal Neurons by GABAergic Chandelier Cells Requires AnkyrinG-Associated L1CAM. Neuron. 102 (2), 358-372 (2019).
- Hofflin, F., et al. Heterogeneity of the Axon Initial Segment in Interneurons and Pyramidal Cells of Rodent Visual Cortex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 332 (2017).
- Schluter, A., et al. Structural Plasticity of Synaptopodin in the Axon Initial Segment during Visual Cortex Development. Cerebral Cortex. 27 (9), 4662-4675 (2017).
- Kuba, H., Oichi, Y., Ohmori, H. Presynaptic activity regulates Na(+) channel distribution at the axon initial segment. Nature. 465 (7301), 1075-1078 (2010).
- Grubb, M. S., Burrone, J. Activity-dependent relocation of the axon initial segment fine-tunes neuronal excitability. Nature. 465 (7301), 1070-1074 (2010).
- Pan, Z., et al. A common ankyrin-G-based mechanism retains KCNQ and NaV channels at electrically active domains of the axon. Journal of Neuroscience. 26 (10), 2599-2613 (2006).
- Cooper, E. C. Made for “anchorin”: Kv7.2/7.3 (KCNQ2/KCNQ3) channels and the modulation of neuronal excitability in vertebrate axons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (2), 185-192 (2011).
- Zhou, D., et al. AnkyrinG is required for clustering of voltage-gated Na channels at axon initial segments and for normal action potential firing. The Journal of Cell Biology. 143 (5), 1295-1304 (1998).
- Kordeli, E., Lambert, S., Bennett, V. AnkyrinG. A new ankyrin gene with neural-specific isoforms localized at the axonal initial segment and node of Ranvier. Journal of Biological Chemistry. 270 (5), 2352-2359 (1995).
- Jenkins, P. M., et al. Giant ankyrin-G: a critical innovation in vertebrate evolution of fast and integrated neuronal signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 957-964 (2015).
- Jenkins, P. M., et al. E-cadherin polarity is determined by a multifunction motif mediating lateral membrane retention through ankyrin-G and apical-lateral transcytosis through clathrin. Journal of Biological Chemistry. 288 (20), 14018-14031 (2013).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocol. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Berger, S. L., et al. Localized Myosin II Activity Regulates Assembly and Plasticity of the Axon Initial Segment. Neuron. 97 (3), 555-570 (2018).
- Yang, R., et al. Neurodevelopmental mutation of giant ankyrin-G disrupts a core mechanism for axon initial segment assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 116 (39), 19717-19726 (2019).
