Gebruik van primaire gekweekte hippocampale neuronen om de assemblage van axon-initiële segmenten te bestuderen
Summary
Hier beschreven we een protocol om de assemblage en structuur van de axon initiële segmenten (AIS) van hippocampale neuronen die geen vooraf geassembleerde AIS missen vanwege de afwezigheid van een gigantische ankyrine-G kwantitatief te bestuderen.
Abstract
Neuronale axon initiële segmenten (AIS) zijn plaatsen van initiatie van actiepotentiaal en zijn uitgebreid bestudeerd op hun moleculaire structuur, assemblage en activiteitsafhankelijke plasticiteit. Giant ankyrine-G, de hoofdorganisator van AIS, associeert direct met membraan-spanning gated sodium (VSVG) en kaliumkanalen (KCNQ2/3), evenals 186 kDa neurofascine, een L1CAM celadhesiemolecuul. Giant ankyrine-G bindt ook aan en rekruteert cytoplasmatische AIS moleculen waaronder bèta-4-spectrine, en de microtubulusbindende eiwitten, EB1/EB3 en Ndel1. Reuze ankyrine-G is voldoende om AIS-vorming in ankyrine-G-deficiënte neuronen te redden. Ankyrine-G omvat ook een kleinere 190 kDa isoform gelegen op dendritische stekels in plaats van de AIS, die niet in staat is om zich te richten op de AIS of het redden van de AIS in ankyrine-G-deficiënte neuronen. Hier beschreven we een protocol met gekweekte hippocampale neuronen van ANK3-E22/23-floxmuizen, die, wanneer getransfecteerd met Cre-BFP, verlies van alle isovorm van ankyrine-G vertonen en de vorming van AIS belemmeren. Gecombineerd met een gemodificeerd Banker glia/neuron co-cultuursysteem, ontwikkelden we een methode om ankyrine-G null neuronen te transfecteren met een 480 kDa ankyrine-G-GFP plasmide, wat voldoende is om de vorming van AIS te redden. We gebruiken verder een kwantificeringsmethode, ontwikkeld door Salzer en collega’s om te gaan met variatie in AIS-afstand tot de neuronale cellichamen die optreedt in hippocampale neuronculturen. Dit protocol maakt kwantitatieve studies van de de novo assemblage en dynamisch gedrag van AIS mogelijk.
Introduction
Het axon initiële segment bevindt zich bij het proximale axon in de meeste gewervelde neuronen. Functioneel gezien is AIS waar actiepotentiaal wordt geïnitieerd vanwege de hoge dichtheid van spanningspoortnatriumkanalen in deze regio. AIS van sommige excitatory neuronen zijn ook gericht door remmende interneurons door het vormen van GABAergic synapsen1,2,3. Daarom is AIS een kritieke locatie om celsignalering te integreren en de prikkelbaarheid van neuronen te moduleren. AIS is normaal gesproken 20-60 μm lang en bevindt zich binnen 20 μm van het cellichaam. De lengte en positie van AIS varieert in neuronen in hersengebieden, evenals in verschillende ontwikkelingsstadia van hetzelfde neuron4,5. Geaccumuleerd bewijs suggereerde dat de samenstelling en positie van AIS dynamisch zijn in het reageren op de verandering van neuronale activiteit4,5,6,7.
480 kDa ankyrin-G is de hoofdorganisator van AIS. 480 kDa ankyrine-G is een membraan geassocieerd adaptereiwit dat zich direct bindt aan spanning gated natriumkanalen en andere belangrijke AIS-eiwitten, waaronder beta4-spectrin, KCNQ2/3 kanalen die natriumkanaalactiviteit8,9en 186 kDa neurofascine moduleren, een L1CAM die GABAergische synapsen naar de AIS2,10leidt . 480 kDa ankyrine-G deelt canonieke ankyrinedomeinen die te vinden zijn in de korte 190 kDa ankyrine-G isoform (ANK repeats, spectrin binding domain, regulatory domain), maar onderscheiden zich door een gigantische exon die alleen in gewervelde dieren voorkomt en specifiek wordt uitgedrukt in neuronen (Figuur 1A)11,12. Het 480 kDa ankyrine-G neuron specifiek domein (NSD) is vereist voor AIS-vorming12. De 190 kDa ankyrine-G bevordert geen AIS-assemblage of richt zich niet op AIS in ankyrine-G-null neuronen12. Echter, 190 kDa ankyrine-G is geconcentreerd op de AIS met 480 kDa ankyrine-G12. Dit vermogen van de 190 kDa ankyrine-G om zich te richten op voorgemonteerde AIS van wildtype neuronen is een bron van verwarring in de literatuur geweest en heeft de waardering van de kritische gespecialiseerde functies van de 480 kDa ankyrine-G in AIS-assemblage vertraagd. Daarom is het van cruciaal belang om AIS-assemblage te bestuderen in ankyrine-G-null neuronen die geen vooraf geassembleerde AIS hebben.
Hier presenteren we een methode om de assemblage en structuur van de AIS te bestuderen met behulp van gekweekte hippocampale neuronen van ANK3-E22/23-flox muizen die alle isovormen van ankyrine-G13 elimineert (Figuur 1B). Door neuronen te transfecteren met een Cre-BFP-constructie voordat AIS wordt geassembleerd, genereerden we ankyrine-G-deficiënte neuronen die volledig geen AIS hadden (Figuur 1B, Figuur 2). De assemblage van AIS wordt volledig gered na co-transfectie van 480 kDa ankyrine-G-GFP plasmide met een Cre-BFP plasmide. Deze methode biedt een manier om de AIS-assemblage te bestuderen in een niet-voorgemonteerde AIS-omgeving. We hebben ook het glia-neuron co-cultuursysteem van Gary Banker aangepast zonder antibiotica te gebruiken, eerder ontworpen voor embryonale dag 18 neuronen, voor toepassing op postnatale muisneuronen en een AIS-kwantificeringsmethode aangepast aan gemiddelde AIS-metingen van meerdere neuronen om de variatie van AIS14,15te normaliseren .
Protocol
Representative Results
Discussion
De assemblage van AIS wordt georganiseerd door 480 kDa ankyrin-G. Ankyrine-G heeft echter kortere isovormen die zich kunnen richten op de AIS van wildtype neuronen, wat kan leiden tot problemen bij de interpretatie van structuurfunctieanalyses van AIS-assemblage. Hier presenteren we een methode met neuronen van ANK3-E22/23-flox muizen die studie van de novo assemblage van de AIS mogelijk maakt. Door te transfecteren met Cre-BFP op 3 div, elimineren we alle endogene isovormen van ankyrine-G. We kunnen oo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken Dr. Gary Banker voor suggestie over neuronaal cultuur protocol. Dit werk wordt ondersteund door het Howard Hughes Medical Institute, een beurs van NIH, en een George Barth Geller begiftigd hoogleraarschap (V.B.).
Materials
| 10xHBSS | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| 18mm coverglass (1.5D) | Fisher Scientific | 12-545-84-1D | |
| 190kDa ankyrin-G-GFP | Addgene | #31059 | |
| 2.5% Tripsin without phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| 480kDa ankyrin-G-GFP | lab made | Provide upon request | |
| ANK3-E22/23f/f mice | JAX | Stock No: 029797 | B6.129-Ank3tm2.1Bnt/J; |
| B27 serum-free supplement | Thermo Fisher Scientific | A3582801 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Cell strainer with 70-mm mesh | BD Biosciences | 352350 | |
| Ceramic coverslip-staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| Cre-BFP | Addgene | #128174 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995073 | |
| GlutaMAX-I supplement | Thermo Fisher Scientific | A1286001 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668030 | |
| MEM with Earle’s salts and L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | |
| Nitric acid 70% | Sigma-Aldrich | 225711 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Poly-L-lysine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 26124-78-7 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 |
References
- Nelson, A. D., et al. Correction: Ankyrin-G regulates forebrain connectivity and network synchronization via interaction with GABARAP. Molecular Psychiatry. , (2019).
- Tseng, W. C., Jenkins, P. M., Tanaka, M., Mooney, R., Bennett, V. Giant ankyrin-G stabilizes somatodendritic GABAergic synapses through opposing endocytosis of GABAA receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 1214-1219 (2015).
- Tai, Y., Gallo, N. B., Wang, M., Yu, J. R., Van Aelst, L. Axo-axonic Innervation of Neocortical Pyramidal Neurons by GABAergic Chandelier Cells Requires AnkyrinG-Associated L1CAM. Neuron. 102 (2), 358-372 (2019).
- Hofflin, F., et al. Heterogeneity of the Axon Initial Segment in Interneurons and Pyramidal Cells of Rodent Visual Cortex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 332 (2017).
- Schluter, A., et al. Structural Plasticity of Synaptopodin in the Axon Initial Segment during Visual Cortex Development. Cerebral Cortex. 27 (9), 4662-4675 (2017).
- Kuba, H., Oichi, Y., Ohmori, H. Presynaptic activity regulates Na(+) channel distribution at the axon initial segment. Nature. 465 (7301), 1075-1078 (2010).
- Grubb, M. S., Burrone, J. Activity-dependent relocation of the axon initial segment fine-tunes neuronal excitability. Nature. 465 (7301), 1070-1074 (2010).
- Pan, Z., et al. A common ankyrin-G-based mechanism retains KCNQ and NaV channels at electrically active domains of the axon. Journal of Neuroscience. 26 (10), 2599-2613 (2006).
- Cooper, E. C. Made for “anchorin”: Kv7.2/7.3 (KCNQ2/KCNQ3) channels and the modulation of neuronal excitability in vertebrate axons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (2), 185-192 (2011).
- Zhou, D., et al. AnkyrinG is required for clustering of voltage-gated Na channels at axon initial segments and for normal action potential firing. The Journal of Cell Biology. 143 (5), 1295-1304 (1998).
- Kordeli, E., Lambert, S., Bennett, V. AnkyrinG. A new ankyrin gene with neural-specific isoforms localized at the axonal initial segment and node of Ranvier. Journal of Biological Chemistry. 270 (5), 2352-2359 (1995).
- Jenkins, P. M., et al. Giant ankyrin-G: a critical innovation in vertebrate evolution of fast and integrated neuronal signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 957-964 (2015).
- Jenkins, P. M., et al. E-cadherin polarity is determined by a multifunction motif mediating lateral membrane retention through ankyrin-G and apical-lateral transcytosis through clathrin. Journal of Biological Chemistry. 288 (20), 14018-14031 (2013).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocol. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Berger, S. L., et al. Localized Myosin II Activity Regulates Assembly and Plasticity of the Axon Initial Segment. Neuron. 97 (3), 555-570 (2018).
- Yang, R., et al. Neurodevelopmental mutation of giant ankyrin-G disrupts a core mechanism for axon initial segment assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 116 (39), 19717-19726 (2019).
