Uso di neuroni ippocampali coltivati primari per studiare l'assemblaggio dei segmenti iniziali di Axon
Summary
Qui, abbiamo descritto un protocollo per studiare quantitativamente l’assemblaggio e la struttura dei segmenti iniziali di axon (AIS) dei neuroni ippocampali che mancano di AIS pre-assemblato a causa dell’assenza di un anchirina-G gigante.
Abstract
I segmenti iniziali dell’assone neuronale (AIS) sono siti di iniziazione di potenziali d’azione e sono stati ampiamente studiati per la loro struttura molecolare, assemblaggio e plasticità dipendente dall’attività. L’anchirina gigante-G, il principale organizzatore dell’AIS, si associa direttamente ai canali del sodio gated al sodio (VSVG) e del potassio (KCNQ2/3), nonché alla neurofascina da 186 kDa, una molecola di adesione cellulare L1CAM. L’anchirina gigante-G si lega e recluta anche molecole di AIS citoplasmatiche tra cui beta-4-spectrin, e le proteine leganti i microtubuli, EB1/EB3 e Ndel1. L’anchirina gigante-G è sufficiente per salvare la formazione di AIS in neuroni carenti di anchirina-G. L’anchirina-G include anche un isoforma più piccolo da 190 kDa situato alle spine dendritiche invece dell’AIS, che non è in grado di mirare all’AIS o di salvare l’AIS in neuroni carenti di anchirina-G. Qui, abbiamo descritto un protocollo che utilizza neuroni ippocampali coltivati da topi ANK3-E22/23-flox, che, se trasfettato con Cre-BFP mostrano la perdita di tutta l’isoforma di anchirina-G e compromettono la formazione di AIS. Combinato un sistema di co-coltura Banker glia/neurone modificato, abbiamo sviluppato un metodo per trasfetto i neuroni nulli anchirina-G con un plasmide anchirina-G-GFP da 480 kDa, che è sufficiente per salvare la formazione di AIS. Utilizziamo inoltre un metodo di quantificazione, sviluppato da Salzer e colleghi per affrontare la variazione della distanza AIS dai corpi cellulari neuronali che si verifica nelle colture neuronali ippocampali. Questo protocollo consente studi quantitativi sull’assemblaggio de novo e sul comportamento dinamico dell’AIS.
Introduction
Il segmento iniziale dell’assone si trova all’assone prossimale nella maggior parte dei neuroni vertebrati. Funzionalmente, AIS è il luogo in cui vengono avviati potenziali d’azione a causa dell’alta densità dei canali del sodio gated di tensione in questa regione. L’AIS di alcuni neuroni eccitatori è anche preso di mira da internauri inibitori formando sinapsi GABAergiche1,2,3. Pertanto, AIS è un sito critico per integrare la segnalazione cellulare e modulare l’eccitabilità dei neuroni. AIS è normalmente lungo 20-60 μm e si trova entro 20 μm dal corpo cellulare. La lunghezza e la posizione dell’AIS varia nei neuroni tra le regioni cerebrali, così come in diversi stadi di sviluppo dello stessoneurone 4,5. Le prove accumulate hanno suggerito che la composizione e la posizione dell’AIS sono dinamiche nel rispondere al cambiamento dell’attivitàneuronale4,5,6,7.
480 kDa ankyrin-G è il master organizer di AIS. 480 kDa anchirina-G è una proteina adattatore associata alla membrana che si lega direttamente ai canali del sodio gated di tensione e ad altre principali proteine AIS tra cui beta4-spectrina, canali KCNQ2/3 che modulano l’attività del canale del sodio8,9e 186 kDa neurofascina, un L1CAM che dirige le sinapsi GABAergice all’AIS2,10. 480 kDa ankyrin-G condivide domini di anchirina canonica trovati nel breve isoforma anchirina-G da 190 kDa (ANK ripete, dominio legante spectrin, dominio regolatore), ma si distinguono per un esone gigante che si trova solo nei vertebrati ed è specificamente espresso nei neuroni(Figura 1A)11,12. Il dominio specifico del neurone anchirina-G da 480 kDa (NSD) è necessario per la formazioneDIA 12. L’anchirina-G da 190 kDa non promuove l’assemblaggio AIS o l’AIS bersaglio nei neuroni anchirina-G-null12. Tuttavia, 190 kDa anchirina-G sono concentrati nell’AIS contenente 480 kDa anchirina-G12. Questa capacità dell’anchirina-G da 190 kDa di colpire l’AIS pre-assemblato dei neuroni di tipo selvatico è stata una fonte di confusione nella letteratura e ha rallentato l’apprezzamento delle funzioni critiche specializzate dell’anchirina-G da 480 kDa nell’assemblaggio AIS. Pertanto, è fondamentale studiare l’assemblaggio AIS in neuroni anchirina-G-null che mancano di un AIS pre-assemblato.
Qui presentiamo un metodo per studiare l’assemblaggio e la struttura dell’AIS utilizzando neuroni ippocampali coltivati da topi ANK3-E22/23-flox che elimina tutte le isoforme di anchirina-G13 (Figura 1B). Trasfettando i neuroni con un costrutto Cre-BFP prima che l’AIS sia assemblato, abbiamo generato neuroni carenti di anchirina-G completamente privi di AIS (Figura 1B, Figura 2). L’assemblaggio dell’AIS è completamente salvato a seguito della co-trasfezione di 480 kDa anchirina-G-GFP plasmide con un plasmide Cre-BFP. Questo metodo consente di studiare l’assembly AIS in un ambiente AIS non preassemblato. Abbiamo anche modificato il sistema di co-coltura glia-neurone da Gary Banker senza utilizzare antibiotici, precedentemente progettato per i neuroni del giorno embrionale 18, perl’applicazioneai neuroni del topo postnatale e adattato un metodo di quantificazione AIS alle misurazioni medie AIS da più neuroni per normalizzare la variazione di AIS 14,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’assemblaggio dell’AIS è organizzato da 480 kDa ankyrin-G. Tuttavia, l’anchirina-G ha isoforme più corte che possono colpire l’AIS dei neuroni di tipo selvatico, il che può portare a difficoltà nell’interpretazione delle analisi struttura-funzione dell’assemblaggio AIS. Qui presentiamo un metodo che utilizza neuroni di topi ANK3-E22/23-flox che consente lo studio dell’assemblaggio de novo dell’AIS. Transfettando con Cre-BFP a 3 div, eliminiamo tutte le isoforme endogene di anchirina-G. Potremmo anc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dr. Gary Banker per il suggerimento sul protocollo sulla cultura neuronale. Questo lavoro è sostenuto dall’Howard Hughes Medical Institute, una borsa di studio della NIH e una cattedra dotata di George Barth Geller (V.B.).
Materials
| 10xHBSS | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| 18mm coverglass (1.5D) | Fisher Scientific | 12-545-84-1D | |
| 190kDa ankyrin-G-GFP | Addgene | #31059 | |
| 2.5% Tripsin without phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| 480kDa ankyrin-G-GFP | lab made | Provide upon request | |
| ANK3-E22/23f/f mice | JAX | Stock No: 029797 | B6.129-Ank3tm2.1Bnt/J; |
| B27 serum-free supplement | Thermo Fisher Scientific | A3582801 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Cell strainer with 70-mm mesh | BD Biosciences | 352350 | |
| Ceramic coverslip-staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| Cre-BFP | Addgene | #128174 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995073 | |
| GlutaMAX-I supplement | Thermo Fisher Scientific | A1286001 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668030 | |
| MEM with Earle’s salts and L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | |
| Nitric acid 70% | Sigma-Aldrich | 225711 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Poly-L-lysine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 26124-78-7 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 |
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