Utilisation de neurones hippocampiques cultivés primaires pour étudier l’assemblage des segments initiaux axonaux
Summary
Ici, nous avons décrit un protocole pour étudier quantitativement l’assemblage et la structure des segments initiaux d’axone (AIS) des neurones hippocampiques qui manquent d’AIS pré-assemblé en raison de l’absence d’un ankyrin-G géant.
Abstract
Les segments initiaux de l’axone neuronal (AIS) sont des sites d’initiation des potentiels d’action et ont été largement étudiés pour leur structure moléculaire, leur assemblage et leur plasticité dépendante de l’activité. L’ankyrine géante-G, le principal organisateur de l’AIS, s’associe directement aux canaux sodique et potassique (VSVG) et à la tension couvrant la membrane (KCNQ2/3), ainsi qu’à la neurofascine 186 kDa, une molécule d’adhésion cellulaire L1CAM. L’ankyrine-G géante se lie également aux molécules d’AIS cytoplasmiques et les recrute, y compris la bêta-4-spectrine, et les protéines de liaison aux microtubules, EB1/EB3 et Ndel1. L’ankyrine-G géante est suffisante pour sauver la formation d’AIS dans les neurones déficients en ankyrine-G. L’ankyrine-G comprend également une isoforme plus petite de 190 kDa située au niveau des épines dendritiques au lieu de l’AIS, qui est incapable de cibler l’AIS ou de sauver l’AIS dans les neurones déficients en ankyrine-G. Ici, nous avons décrit un protocole utilisant les neurones hippocampal cultivés des souris d’ANK3-E22/23-flox, qui, une fois transfected avec cre-BFP montrent la perte de toute l’isoforme de l’ankyrine-G et altèrent la formation d’AIS. Combiné un système modifié de co-culture de glie de Banker/neurone, nous avons développé une méthode pour transfecter des neurones nuls d’ankyrine-G avec un plasmide ankyrine-G-GFP de 480 kDa, ce qui est suffisant pour sauver la formation d’AIS. Nous utilisons en outre une méthode de quantification, développée par Salzer et ses collègues pour traiter la variation de la distance de l’AIS par rapport aux corps cellulaires neuronaux neuronaux qui se produit dans les cultures de neurones de l’hippocampe. Ce protocole permet des études quantitatives de l’assemblage de novo et du comportement dynamique de l’AIS.
Introduction
Le segment initial de l’axone est situé à l’axone proximal dans la plupart des neurones vertébrés. Fonctionnellement, l’AIS est l’endroit où les potentiels d’action sont initiés en raison de la haute densité des canaux sodiques voltage-gated dans cette région. L’AIS de certains neurones excitateurs est également ciblée par des interneurones inhibiteurs par la formation de synapses GABAergiques1,2,3. Par conséquent, l’AIS est un site essentiel pour intégrer la signalisation cellulaire et moduler l’excitabilité des neurones. L’AIS a normalement une longueur de 20 à 60 μm et se trouve à moins de 20 μm du corps cellulaire. La longueur et la position de l’AIS varient dans les neurones d’une région du cerveau à l’autre, ainsi que dans différents stades de développement du même neurone4,5. Les preuves accumulées suggèrent que la composition et la position de l’AIS sont dynamiques pour répondre au changement de l’activité neuronale4,5,6,7.
480 kDa ankyrin-G est le maître organisateur de l’AIS. L’ankyrine-G 480 kDa est une protéine adaptatrice associée à la membrane qui se lie directement aux canaux sodiques voltageogènes ainsi qu’à d’autres protéines AIS majeures, notamment la beta4-spectrine, les canaux KCNQ2/3 qui modulent l’activité des canaux sodiques8,9et la neurofascine 186 kDa, un L1CAM qui dirige les synapses GABAergiques vers l’AIS2,10. 480 kDa ankyrine-G partage des domaines canoniques d’ankyrine trouvés dans la courte isoforme ankyrine-G de 190 kDa (répétitions ANK, domaine de liaison à la spectrine, domaine régulateur), mais se distinguent par un exon géant que l’on ne trouve que chez les vertébrés et qui est spécifiquement exprimé dans les neurones(figure 1A)11,12. Le domaine spécifique du neurone ankyrine-G de 480 kDa (NSD) est requis pour la formation de l’AIS12. L’ankyrine-G de 190 kDa ne favorise pas l’assemblage d’AIS ni ne cible l’AIS dans les neurones ankyrine-G-null12. Cependant, 190 kDa d’ankyrine-G est concentré au niveau de l’AIS contenant 480 kDa d’ankyrine-G12. Cette capacité de l’ankyrine-G de 190 kDa à cibler l’AIS pré-assemblé des neurones de type sauvage a été une source de confusion dans la littérature et a ralenti l’appréciation des fonctions spécialisées critiques de l’ankyrine-G de 480 kDa dans l’assemblage d’AIS. Par conséquent, il est essentiel d’étudier l’assemblage d’AIS dans les neurones ankyrine-G-null qui n’ont pas d’AIS pré-assemblé.
Ici, nous présentons une méthode pour étudier l’assemblage et la structure de l’AIS en utilisant des neurones hippocampiques cultivés à partir de souris ANK3-E22/23-flox qui élimine toutes les isoformes de l’ankyrine-G13 (Figure 1B). En transfectant des neurones avec une construction Cre-BFP avant que l’AIS ne soit assemblé, nous avons généré des neurones déficients en ankyrine-G qui manquaient complètement d’AIS(Figure 1B, Figure 2). L’assemblage de l’AIS est entièrement sauvé après co-transfection du plasmide ankyrine-G-GFP de 480 kDa avec un plasmide Cre-BFP. Cette méthode permet d’étudier l’assemblage AIS dans un environnement AIS non pré-assemblé. Nous avons également modifié le système de co-culture glia-neurone de Gary Banker sans utiliser d’antibiotiques, précédemment conçus pour les neurones embryonnaires du jour 18, pour une application aux neurones postnatals de souris et adapté une méthode de quantification AIS pour faire la moyenne des mesures AIS de plusieurs neurones afin de normaliser la variation de l’AIS14,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’assemblage de l’AIS est organisé par 480 kDa ankyrine-G. Cependant, l’ankyrine-G a des isoformes plus courtes qui peuvent cibler l’AIS des neurones de type sauvage, ce qui peut entraîner des difficultés dans l’interprétation des analyses structure-fonction de l’assemblage de l’AIS. Nous présentons ici une méthode utilisant des neurones de souris ANK3-E22/23-flox qui permet l’étude de l’assemblage de novo de l’AIS. En transfectant avec Cre-BFP à 3 div, nous éliminons toute…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Gary Banker pour sa suggestion sur le protocole de culture neuronale. Ce travail est soutenu par le Howard Hughes Medical Institute, une subvention des NIH et une chaire de professeure dotée de George Barth Geller (V.B.).
Materials
| 10xHBSS | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| 18mm coverglass (1.5D) | Fisher Scientific | 12-545-84-1D | |
| 190kDa ankyrin-G-GFP | Addgene | #31059 | |
| 2.5% Tripsin without phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| 480kDa ankyrin-G-GFP | lab made | Provide upon request | |
| ANK3-E22/23f/f mice | JAX | Stock No: 029797 | B6.129-Ank3tm2.1Bnt/J; |
| B27 serum-free supplement | Thermo Fisher Scientific | A3582801 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Cell strainer with 70-mm mesh | BD Biosciences | 352350 | |
| Ceramic coverslip-staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| Cre-BFP | Addgene | #128174 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995073 | |
| GlutaMAX-I supplement | Thermo Fisher Scientific | A1286001 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668030 | |
| MEM with Earle’s salts and L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | |
| Nitric acid 70% | Sigma-Aldrich | 225711 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Poly-L-lysine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 26124-78-7 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 |
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