שימוש בנוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס כדי לחקור את ההרכבה של מקטעים ראשוניים של אקסון
Summary
כאן, תיארנו פרוטוקול כדי לחקור כמותית את ההרכבה והמבנה של קטעים ראשוניים אקסון (AIS) של נוירונים היפוקמפוס חסר AIS מורכב מראש בשל היעדר ankyrin-G ענק.
Abstract
מקטעים ראשוניים של אקסון עצבי (AIS) הם אתרים של ייזום פוטנציאל פעולה ונחקרו בהרחבה עבור המבנה המולקולרי שלהם, הרכבה פלסטיות תלוית פעילות. ענק ankyrin-G, המארגן הראשי של AIS, ישירות מקשר עם מתח פורש ממברנה מגודר נתרן (VSVG) וערוצי אשלגן (KCNQ2/3), כמו גם 186 kDa נוירופסין, מולקולת הידבקות בתא L1CAM. ענק ankyrin-G גם נקשר ומגייס מולקולות AIS ציטופלזמי כולל בטא-4-spectrin, ואת החלבונים מחייב microtubule, EB1/EB3 ו Ndel1. Ankyrin-G ענק מספיק כדי להציל היווצרות AIS בנוירונים לקויים ankyrin-G. Ankyrin-G כולל גם איזופורם קטן יותר של 190 kDa הממוקם בקוצים דנדריטיים במקום AIS, אשר אינו מסוגל למקד את AIS או להציל את AIS בנוירונים ankyrin-G לקוי. כאן, תיארנו פרוטוקול באמצעות נוירונים היפוקמפוס מתורבתים מעכברי ANK3-E22/23-flox, אשר, כאשר מודבק עם Cre-BFP להפגין אובדן של כל איזופורם של ankyrin-G ולפגוע בהיווצרות של AIS. בשילוב מערכת תרבות משותפת של בנקר גליה/נוירון שונה, פיתחנו שיטה להחדיר נוירונים ריקים ankyrin-G עם 480 kDa ankyrin-G-GFP plasmid, וזה מספיק כדי להציל את היווצרות של AIS. בנוסף, אנו משתמשים בשיטת כימות, שפותחה על ידי סלצר ועמיתיו כדי להתמודד עם שונות במרחק AIS מגופי התאים העצביים המתרחשת בתרבויות נוירונים בהיפוקמפוס. פרוטוקול זה מאפשר מחקרים כמותיים של הרכבת דה נובו והתנהגות דינמית של AIS.
Introduction
הקטע הראשוני של האקסון ממוקם באקסון הפרוקסימלי ברוב הנוירונים החולייתנים. מבחינה פונקציונלית, AIS הוא המקום שבו פוטנציאל הפעולה הם יזמו בשל צפיפות גבוהה של ערוצי נתרן מגודר מתח באזור זה. AIS של כמה נוירונים סינאפסות הם גם ממוקדים על ידי interneurons מעכבות באמצעות יצירת סינפסות GABAergic1,2,3. לכן, AIS הוא אתר קריטי כדי לשלב איתות התא לווסת את ההתרגשות של נוירונים. AIS הוא בדרך כלל 20-60 מיקרומטר אורך וממוקם בתוך 20 מיקרומטר של גוף התא. האורך והמיקום של AIS משתנה בנוירונים על פני אזורי המוח, כמו גם בשלבים התפתחותיים שונים של אותו נוירון4,5. ראיות מצטברות הראו כי הרכב ומיקום של AIS הם דינמיים בתגובה לשינוי של פעילות עצבית4,5,6,7.
480 kDa אנקירין-G הוא המארגן הראשי של AIS. 480 kDa ankyrin-G הוא חלבון מתאם הקשור לקרום שנקשר ישירות לערוצי נתרן מגודרים במתח, כמו גם לחלבוני AIS מרכזיים אחרים כולל בטא4-ספקטרין, KCNQ2/3 ערוצים לווסת פעילות ערוץ נתרן8,9, ו 186 kDa נוירופצין, L1CAM שמכוון סינפסות GABAergic ל AIS2,10. 480 kDa ankyrin-G מניות ankyrin קנונית תחומים שנמצאו קצר 190 kDa ankyrin-G isoform (ANK חוזר, תחום מחייב spectrin, תחום רגולטורי), אבל הם נבדלים על ידי אקסון ענק שנמצא רק בעלי חוליות ומתבטא במיוחד נוירונים (איור 1A)11,12. 480 kDa ankyrin-G נוירון ספציפי תחום (NSD) נדרש עבור היווצרות AIS12. 190 kDa ankyrin-G אינו מקדם הרכבה AIS או יעד AIS בנוירונים ankyrin-G-null12. עם זאת, 190 kDa ankyrin-G מרוכז ב- AIS המכיל 480 kDa אנקירין-G12. יכולת זו של 190 kDa ankyrin-G למקד AIS מורכב מראש של נוירונים wildtype כבר מקור לבלבול בספרות האטה את ההערכה של פונקציות מיוחדות קריטיות של 480 kDa ankyrin-G בהרכבה AIS. לכן, זה קריטי ללמוד הרכבה AIS בנוירונים ankyrin-G-null כי חסר AIS מורכב מראש.
כאן, אנו מציגים שיטה לחקר ההרכבה והמבנה של ה- AIS באמצעות נוירונים היפוקמפוסים מתורבתים מעכברי ANK3-E22/23-flox המבטלת את כל האיזופורמות של ankyrin-G13 (איור 1B). על ידי חציית נוירונים עם מבנה Cre-BFP לפני הרכבת AIS, יצרנו נוירונים נטולי אנקירין-G שחסרים לחלוטין AIS(איור 1B, איור 2). ההרכבה של AIS הוא הציל באופן מלא לאחר שיתוף transfection של 480 kDa ankyrin-G-GFP פלסמיד עם פלסמיד Cre-BFP. שיטה זו מספקת דרך ללמוד את הרכבת AIS בסביבת AIS שאינה מורכבת מראש. כמו כן, שינינו את מערכת התרבות המשותפת גליה-נוירון מגארי בנקר מבלי להשתמש באנטיביוטיקה, שתוכננה בעבר עבור נוירונים של יום עוברי 18, ליישום לנוירונים של עכבר לאחר הלידה והתאמנו שיטת כמויות AIS למדידות AIS ממוצעות מתאי עצב מרובים כדי לנרמל את הווריאציה של AIS14,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההרכבה של AIS מאורגנת על ידי 480 kDa ankyrin-G. עם זאת, ankyrin-G יש איזופורמים קצרים יותר שיכולים למקד את AIS של נוירונים wildtype, אשר עלול להוביל לקושי בפרשנות של ניתוחים מבנה פונקציה של הרכבת AIS. כאן אנו מציגים שיטה באמצעות נוירונים מעכברי ANK3-E22/23-flox המאפשרת מחקר של הרכבה דה נובו של AIS. על ידי הצטלבת…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד”ר גארי בנקר על ההצעה לפרוטוקול התרבות העצבית. עבודה זו נתמכת על ידי המכון הרפואי הווארד יוז, מענק מ- NIH, וג’ורג ‘ בארת גלר העניק פרופסור (V.B.).
Materials
| 10xHBSS | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| 18mm coverglass (1.5D) | Fisher Scientific | 12-545-84-1D | |
| 190kDa ankyrin-G-GFP | Addgene | #31059 | |
| 2.5% Tripsin without phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| 480kDa ankyrin-G-GFP | lab made | Provide upon request | |
| ANK3-E22/23f/f mice | JAX | Stock No: 029797 | B6.129-Ank3tm2.1Bnt/J; |
| B27 serum-free supplement | Thermo Fisher Scientific | A3582801 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Cell strainer with 70-mm mesh | BD Biosciences | 352350 | |
| Ceramic coverslip-staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| Cre-BFP | Addgene | #128174 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995073 | |
| GlutaMAX-I supplement | Thermo Fisher Scientific | A1286001 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668030 | |
| MEM with Earle’s salts and L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | |
| Nitric acid 70% | Sigma-Aldrich | 225711 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Poly-L-lysine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 26124-78-7 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 |
References
- Nelson, A. D., et al. Correction: Ankyrin-G regulates forebrain connectivity and network synchronization via interaction with GABARAP. Molecular Psychiatry. , (2019).
- Tseng, W. C., Jenkins, P. M., Tanaka, M., Mooney, R., Bennett, V. Giant ankyrin-G stabilizes somatodendritic GABAergic synapses through opposing endocytosis of GABAA receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 1214-1219 (2015).
- Tai, Y., Gallo, N. B., Wang, M., Yu, J. R., Van Aelst, L. Axo-axonic Innervation of Neocortical Pyramidal Neurons by GABAergic Chandelier Cells Requires AnkyrinG-Associated L1CAM. Neuron. 102 (2), 358-372 (2019).
- Hofflin, F., et al. Heterogeneity of the Axon Initial Segment in Interneurons and Pyramidal Cells of Rodent Visual Cortex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 332 (2017).
- Schluter, A., et al. Structural Plasticity of Synaptopodin in the Axon Initial Segment during Visual Cortex Development. Cerebral Cortex. 27 (9), 4662-4675 (2017).
- Kuba, H., Oichi, Y., Ohmori, H. Presynaptic activity regulates Na(+) channel distribution at the axon initial segment. Nature. 465 (7301), 1075-1078 (2010).
- Grubb, M. S., Burrone, J. Activity-dependent relocation of the axon initial segment fine-tunes neuronal excitability. Nature. 465 (7301), 1070-1074 (2010).
- Pan, Z., et al. A common ankyrin-G-based mechanism retains KCNQ and NaV channels at electrically active domains of the axon. Journal of Neuroscience. 26 (10), 2599-2613 (2006).
- Cooper, E. C. Made for “anchorin”: Kv7.2/7.3 (KCNQ2/KCNQ3) channels and the modulation of neuronal excitability in vertebrate axons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (2), 185-192 (2011).
- Zhou, D., et al. AnkyrinG is required for clustering of voltage-gated Na channels at axon initial segments and for normal action potential firing. The Journal of Cell Biology. 143 (5), 1295-1304 (1998).
- Kordeli, E., Lambert, S., Bennett, V. AnkyrinG. A new ankyrin gene with neural-specific isoforms localized at the axonal initial segment and node of Ranvier. Journal of Biological Chemistry. 270 (5), 2352-2359 (1995).
- Jenkins, P. M., et al. Giant ankyrin-G: a critical innovation in vertebrate evolution of fast and integrated neuronal signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 957-964 (2015).
- Jenkins, P. M., et al. E-cadherin polarity is determined by a multifunction motif mediating lateral membrane retention through ankyrin-G and apical-lateral transcytosis through clathrin. Journal of Biological Chemistry. 288 (20), 14018-14031 (2013).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocol. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Berger, S. L., et al. Localized Myosin II Activity Regulates Assembly and Plasticity of the Axon Initial Segment. Neuron. 97 (3), 555-570 (2018).
- Yang, R., et al. Neurodevelopmental mutation of giant ankyrin-G disrupts a core mechanism for axon initial segment assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 116 (39), 19717-19726 (2019).
