Uso de neurônios hipocampais primários para estudar a montagem de segmentos iniciais de Axon
Summary
Aqui, descrevemos um protocolo para estudar quantitativamente a montagem e estrutura dos segmentos iniciais de axônio (AIS) de neurônios hipocampais que carecem de AIS pré-montada devido à ausência de um anquilírin-G gigante.
Abstract
Os segmentos iniciais do axônio neuronal (AIS) são locais de iniciação de potenciais de ação e têm sido extensivamente estudados para sua estrutura molecular, montagem e plasticidade dependente da atividade. Ankyrin-G gigante, o principal organizador do AIS, associa-se diretamente com os canais de adesão de tensão de tensão de membrana (VSVG) e canais de potássio (KCNQ2/3), bem como neurofascina de 186 kDa, uma molécula de adesão celular L1CAM. Ankyrin-G gigante também se liga e recruta moléculas citoplasmáticas de AIS, incluindo beta-4-spectrin, e as proteínas de ligação de microtúbulos, EB1/EB3 e Ndel1. Anquilo-G gigante é suficiente para resgatar a formação de AIS em neurônios deficientes de ankyrin-G. Ankyrin-G também inclui um isoform menor de 190 kDa localizado em espinhos dendráticos em vez da AIS, que é incapaz de atingir a AIS ou resgatar o AIS em neurônios deficientes de ankyrin-G. Aqui, descrevemos um protocolo usando neurônios hipocampais cultivados de camundongos ANK3-E22/23-flox, que, quando transfectados com Cre-BFP exibem perda de toda a isóforme de ankyrina-G e prejudicam a formação de AIS. Combinado um sistema de co-cultura Banker glia/neuron modificado, desenvolvemos um método para transfetar neurônios anquilino-G nulos com um plasmídeo ankyrin-G-GFP de 480 kDa, o que é suficiente para resgatar a formação de AIS. Utilizamos ainda um método de quantificação, desenvolvido por Salzer e colegas para lidar com a variação da distância AIS dos corpos de células neuronais que ocorre nas culturas de neurônios hipocampais. Este protocolo permite estudos quantitativos da montagem de novo e comportamento dinâmico da AIS.
Introduction
O segmento inicial do axônio está localizado no axônio proximal na maioria dos neurônios vertebrados. Funcionalmente, a AIS é onde os potenciais de ação são iniciados devido à alta densidade de canais de sódio fechados por tensão nesta região. AIS de alguns neurônios excitatórios também são alvo de interneurônios inibitórios através da formação de sinapses GABAérgicas1,2,3. Portanto, a AIS é um local crítico para integrar a sinalização celular e modular a excitabilidade dos neurônios. A IS tem normalmente 20-60 μm de comprimento e está localizada dentro de 20 μm do corpo celular. O comprimento e a posição da AIS variam em neurônios entre regiões cerebrais, bem como em diferentes estágios de desenvolvimento do mesmo neurônio4,5. Evidências acumuladas sugerem que a composição e a posição da AIS são dinâmicas na resposta à mudança da atividade neuronal4,5,6,7.
480 kDa ankyrin-G é o principal organizador da AIS. 480 kDa ankyrin-G é uma proteína adaptadora associada à membrana que se liga diretamente aos canais de sódio fechados de tensão, bem como outras proteínas AIS importantes, incluindo beta4-spectrina, KCNQ2/3 canais que modulam a atividade do canal de sódio8,9e 186 kDa neurofascina, uma L1CAM que direciona as sínteses GABAergic para o AIS2,10. 480 kDa ankyrin-G compartilha domínios de ankyrina canônica encontrados na pequena isoforma ankyrin-G de 190 kDa (se repete ANK, domínio vinculante de espectros, domínio regulatório), mas são distinguidos por uma exon gigante que é encontrada apenas em vertebrados e é expressa especificamente em neurônios(Figura 1A)11,12. O domínio específico do neurônio ankyrin-G de 480 kDa (NSD) é necessário para a formação AIS12. O ankyrin-G de 190 kDa não promove a montagem AIS ou o alvo AIS em neurônios ankyrin-G-null12. No entanto, 190 kDa ankyrin-G está concentrado na AIS contendo 480 kDa ankyrin-G12. Esta habilidade do ankyrin-G de 190 kDa para atingir a AIS pré-montada de neurônios do tipo selvagem tem sido uma fonte de confusão na literatura e retardou a apreciação das funções especializadas críticas do ankyrin-G de 480 kDa na montagem AIS. Portanto, é fundamental estudar a montagem da AIS em neurônios anquilo-G-nulos que carecem de uma AIS pré-montada.
Aqui, apresentamos um método para estudar a montagem e estrutura do AIS utilizando neurônios hipocampais cultivados de camundongos ANK3-E22/23-flox que elimina todas as isoformas de ankyrin-G13 (Figura 1B). Ao transfetar neurônios com uma construção Cre-BFP antes da AIS ser montada, geramos neurônios deficientes ankyrin-G completamente sem uma AIS (Figura 1B, Figura 2). A montagem da AIS é totalmente resgatada após a co-transfecção de 480 kDa ankyrin-G-GFP plasmid com um plasmídeo Cre-BFP. Este método fornece uma maneira de estudar a montagem AIS em um ambiente AIS não pré-montado. Também modificamos o sistema de cocultura glia-neurônio de Gary Banker sem o uso de antibióticos, previamente projetado para o dia 18 neurônios embrionários, para aplicação aos neurônios do camundongo pós-natal e adaptamos um método de quantitação AIS para medições médias de AIS de múltiplos neurônios para normalizar a variação de AIS14,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
A montagem da AIS é organizada por 480 kDa ankyrin-G. No entanto, ankyrin-G tem isóformes mais curtos que podem atingir a AIS de neurônios tipo selvagem, o que pode levar à dificuldade de interpretação das análises estrutura-função do conjunto AIS. Aqui apresentamos um método utilizando neurônios de camundongos ANK3-E22/23-flox que permite o estudo da montagem de novo da AIS. Transfeciando com Cre-BFP em 3 div, eliminamos todas as isoformas endógenas de ankyrin-G. Também poderíamos co-tran…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. Gary Banker por sugestão sobre o protocolo de cultura neuronal. Este trabalho é apoiado pelo Howard Hughes Medical Institute, uma bolsa do NIH, e um professor dotado de George Barth Geller (V.B.).
Materials
| 10xHBSS | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| 18mm coverglass (1.5D) | Fisher Scientific | 12-545-84-1D | |
| 190kDa ankyrin-G-GFP | Addgene | #31059 | |
| 2.5% Tripsin without phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| 480kDa ankyrin-G-GFP | lab made | Provide upon request | |
| ANK3-E22/23f/f mice | JAX | Stock No: 029797 | B6.129-Ank3tm2.1Bnt/J; |
| B27 serum-free supplement | Thermo Fisher Scientific | A3582801 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Cell strainer with 70-mm mesh | BD Biosciences | 352350 | |
| Ceramic coverslip-staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| Cre-BFP | Addgene | #128174 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995073 | |
| GlutaMAX-I supplement | Thermo Fisher Scientific | A1286001 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668030 | |
| MEM with Earle’s salts and L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | |
| Nitric acid 70% | Sigma-Aldrich | 225711 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Poly-L-lysine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 26124-78-7 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 |
References
- Nelson, A. D., et al. Correction: Ankyrin-G regulates forebrain connectivity and network synchronization via interaction with GABARAP. Molecular Psychiatry. , (2019).
- Tseng, W. C., Jenkins, P. M., Tanaka, M., Mooney, R., Bennett, V. Giant ankyrin-G stabilizes somatodendritic GABAergic synapses through opposing endocytosis of GABAA receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 1214-1219 (2015).
- Tai, Y., Gallo, N. B., Wang, M., Yu, J. R., Van Aelst, L. Axo-axonic Innervation of Neocortical Pyramidal Neurons by GABAergic Chandelier Cells Requires AnkyrinG-Associated L1CAM. Neuron. 102 (2), 358-372 (2019).
- Hofflin, F., et al. Heterogeneity of the Axon Initial Segment in Interneurons and Pyramidal Cells of Rodent Visual Cortex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 332 (2017).
- Schluter, A., et al. Structural Plasticity of Synaptopodin in the Axon Initial Segment during Visual Cortex Development. Cerebral Cortex. 27 (9), 4662-4675 (2017).
- Kuba, H., Oichi, Y., Ohmori, H. Presynaptic activity regulates Na(+) channel distribution at the axon initial segment. Nature. 465 (7301), 1075-1078 (2010).
- Grubb, M. S., Burrone, J. Activity-dependent relocation of the axon initial segment fine-tunes neuronal excitability. Nature. 465 (7301), 1070-1074 (2010).
- Pan, Z., et al. A common ankyrin-G-based mechanism retains KCNQ and NaV channels at electrically active domains of the axon. Journal of Neuroscience. 26 (10), 2599-2613 (2006).
- Cooper, E. C. Made for “anchorin”: Kv7.2/7.3 (KCNQ2/KCNQ3) channels and the modulation of neuronal excitability in vertebrate axons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (2), 185-192 (2011).
- Zhou, D., et al. AnkyrinG is required for clustering of voltage-gated Na channels at axon initial segments and for normal action potential firing. The Journal of Cell Biology. 143 (5), 1295-1304 (1998).
- Kordeli, E., Lambert, S., Bennett, V. AnkyrinG. A new ankyrin gene with neural-specific isoforms localized at the axonal initial segment and node of Ranvier. Journal of Biological Chemistry. 270 (5), 2352-2359 (1995).
- Jenkins, P. M., et al. Giant ankyrin-G: a critical innovation in vertebrate evolution of fast and integrated neuronal signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 957-964 (2015).
- Jenkins, P. M., et al. E-cadherin polarity is determined by a multifunction motif mediating lateral membrane retention through ankyrin-G and apical-lateral transcytosis through clathrin. Journal of Biological Chemistry. 288 (20), 14018-14031 (2013).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocol. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Berger, S. L., et al. Localized Myosin II Activity Regulates Assembly and Plasticity of the Axon Initial Segment. Neuron. 97 (3), 555-570 (2018).
- Yang, R., et al. Neurodevelopmental mutation of giant ankyrin-G disrupts a core mechanism for axon initial segment assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 116 (39), 19717-19726 (2019).
