여기에 제시된 다중 궤적 가변 수 탠덤 반복 분석(MLVA) 분석은 어류 병원성 박테리아 Yersinia ruckeri의저렴하고 견고하며 휴대용 고해상도 유전자 형질 분석이 가능합니다. 순수 한 배양에서 시작, 분석 은 다운 스트림 응용 프로그램에 대한 10 층 MLVA 프로파일을 생산하기 위해 멀티 플렉스 PCR 및 모세관 전기 영동을 사용합니다.
Yersinia ruckeri는 전 세계적으로 양식 된 연어의 중요한 병원체이지만,이 박테리아의 후생 동물 조사 (감염 추적 등)에 적합한 간단한 도구가 부족했습니다. 다중 궤적 가변 수 탠덤 반복 분석 (MLVA) 분석은 따라서 회수 된 분리물의 고해상도 지질 분석을위한 쉽게 접근하고 모호한 도구로 개발되었다. 여기에 제시된 MLVA 분석의 경우, DNA는 배양된 Y. ruckeri 샘플에서 추출된 후, 물에 세균세포를 끓여서, PCR용 템플릿으로 상급제를 사용한다. Y. ruckeri 게놈 전체에 흩어져 있는 10개의 가변 수 탠덤 반복(VNTR) 로시를 대상으로 하는 프라이머 쌍은 동일한 사이클링 조건에서 실행되는 두 개의 5플렉스 PCR 반응 사이에 균등하게 분포됩니다. 전방 프라이머는 세 가지 형광 염료 중 하나에 라벨이 부착되어 있습니다. 젤 전기 동에 의한 앰플리코 확인에 따라 PCR 제품은 희석되고 모세관 전기 동극을 겪습니다. 생성된 전기 전형체 프로파일로부터, 각 VNTR 궤위를 나타내는 피크는 크기라고 하며 실리코에서 VNTR 반복 카운트를 계산하기 위해 사용된다. 결과 10자리 MLVA 프로파일은 클러스터 분석에 의한 후생학 평가를 가능하게 하는 최소 스패닝 트리를 생성하는 데 사용됩니다. 수치 MLVA 프로파일 의 형태로 휴대용 출력 데이터는 실험실 전체에서 빠르게 비교되고 시공간적 컨텍스트에 배치될 수 있습니다. 배양 된 식민지에서 상피학 평가에 이르는 전체 절차는 단일 근무일 내에 최대 48 Y. ruckeri 격리에 대해 완료 될 수 있습니다.
그람 음성 박테리아이자 예르시니아과 가족의 일원인 예르시니아 루케리(Yersinia ruckeri)는전세계적으로 양식된 연어어에서 예르시니오시스를 일으킨다. 그것은 한천 매체의 많은 모형에 경작에 의해 감염한 물고기에서 쉽게 진단됩니다, 그러나 최근까지, 거의 세계에 걸쳐 그리고 다른 서식지 (호스트 종 등)에 Y. ruckeri의 인구 구조 그리고 상피학에 관하여 알려지지 않았습니다. Y. ruckeri에 대한 기존의 혈청 화 시스템은 일관성이 없으며 상호 호환성이 부족하며 낮은 역학 적 분해능을 제공합니다. 박테리아에 대한 일부 분자 연구가 수행되어 Multilocus 서열 타이핑 (MLST), 펄스 필드 젤 전기 영동 (PFGE) 또는 전체 게놈서열 (WGS) 분석 2,3,4 와 같은 기술을 채택했습니다. ,5. 그러나 MLST는 일상적인 감염 추적에 대해 충분히 높은 해상도를 제공하지 않지만 PFGE는 노동력을 요구하고 실험실 에서 쉽게 이식할 수 없는 결과를 생성합니다. WGS 분석은 거의 궁극적 인 해결책을 제공하지만, 이러한 분석의 설립 및 구현은 아직 실험실의 상대적으로 적은 수에 제한 남아 전제 기술 및 생물 정보학 기능을 것입니다.
다중 궤적 가변 수 탠덤 반복 분석 (MLVA)은 WGS 분석6,7의거의 일치하는 경우에 유전 적 분해능을 제공하는 간단하고 쉽게 접근 할 수있는 분자 타이핑 도구를 나타냅니다. 이 기술은 선택한 가변 번호 탠덤 반복(VNTR) loci의 반복 수 변화를 기반으로 하므로 전송이 용이한 출력 데이터가 생성되므로 프로파일된 격리된 프로파일을 온라인 데이터베이스와 랩 간에 간단하게 비교할 수 있습니다. MLST는 많은 세균성 병원체의 역학 적 타이핑을위한 금 본위제로 남아 있지만, 연구의 증가는 MLVA 8,9,10의상당히 높은 차별적 힘을 확인합니다. 몇몇 프로토콜은 또한 프란시스셀라 noatunensis, 에지시엘라 피시시다 및 Renibacterium salmoninarum11,12와같은 물고기 병원성 박테리아를 표적으로 하는 간행되었습니다, 13.
여기에 제시 된 10-loci MLVA 프로토콜은 최근 광범위한 Y. ruckeri 인구 연구14의기초를 형성, 한천 재배 식민지에서 DNA의 추출을 포함, 멀티 플렉스 PCR 및 모세관 전기 영동 (CE), 실리코 애플리케이션의 다운스트림이 뒤따릅니다. 각 검사된 분리에 대해, 각각의 개별 VNTR 영역을 대상으로 하는 5개의 형광 표지 프라이머 쌍(6FAM, NED 또는 VIC)을 포함하는 두 개의 멀티플렉스 PCR이 동일한 조건하에서 병렬로 실행됩니다. 겔 전기 영동 (GE)에 의한 PCR 앰플리폰의 검증에 따라, PCR 제품은 CE 분석 전에 희석되고, 각각의 VNTR 궤위를 나타내는 피크는 생성된 일렉트로로그램 파일로부터 크기라고 불린다. CE 철새 패턴의 사소한 시퀀스별 불일치를 차지하는 궤적별 수식과 함께 VNTR CE 크기 호출은 10자리 MLVA 프로파일로 연결되는 VNTR 반복 수를 계산하는 데 사용됩니다. 이들은 후생동물 평가를 위한 입력으로 사용됩니다(예: 최소 스패닝 트리(MST) 다이어그램의 클러스터 분석에 의해).
여기에 제시 된 두 멀티 플렉스 PCR 가난한 템플릿 DNA 품질의 얼굴에 상대적으로 강력한 등장, 하지만 PCR 증폭의 부족은 그럼에도 불구하고 때때로 매우 높은 DNA 농도와 템플릿을 사용할 때 관찰되었다. 이러한 문제는 PCR 이전에 템플릿을 희석하여 쉽게 해결되었습니다. 여기에 채택된 것보다 DNA 추출을 위한 다른 방법(예를 들어, 상용 키트)도 사용될 수 있다.
각 멀티플렉스 PCR 반응에서 5개의 앰플리폰이 예상되지만, 동일한 반응 내의 일부(다르게 레이블이 지정된) VNTR 궤형에는 크기 범위가 겹치기 때문에 시각적으로 구별되는 5개의 대역이 항상 GE에서 기대할 수 있는 것은 아닙니다. 60 분의 최종 PCR 연장 시간은 필요한 경우 단축 될 수있다, 하지만 가능성이 후속 CE 전기 전형체에서 분할 피크의 증가 발생을 초래할 것이다 (아래 참조). 특히 GE 단계의 목적은 순전히 PCR 앰플리콘의 정성적 검증을 위한 것이므로 런타임, 전압 및/또는 겔 레시피가 선호되는 대로 조정될 수 있습니다. 특히 약한 밴드가 GE에 의해 관찰되는 경우, CE 이전에 이들 샘플의 희석 계수를 감소시키는 것이 바람직할 수 있다.
여기에 설명된 CE 프로토콜이 특정 상업용 모세관 전기 동화 장치(재료 표참조)에서 실행되었지만, 다른 CE 시스템은 서로 다른 샘플 요구 사항을 가질 수 있으며, 이로 인해 프로토콜에 대한 일부 수정이 필요할 수 있습니다. . 조각 분석을 위해 적절한 시약/장비, 교정 등에 대한 지침은 해당 CE 시스템 제조업체의 설명서를 참조하십시오. 또한 CE 동안 관찰된 편향된 앰플리톤 이동성 패턴이 다른 MLVA 프로토콜15,16에대해 문서화된 바와 같이 CE 시스템 및/또는 기계 간에 상대적으로 다를 수 있음이 있습니다. 최종(반올림) VNTR 반복 카운트가 영향을 받는 정도에 발생하는 경우 이는 VNTR 반복 수를 결정하는 데 사용되는 궤적 별 변수 s와 i(표 1)를 다시 보정해야 함을 의미합니다. 여기에는 Gulla et al. 201814에설명된 대로 정확한 시퀀스 크기와 CE 크기 호출을 비교하는 플롯의 선형 회귀를 포함합니다.
분할 피크 및 더듬 피크, CE 기반 MLVA 타이핑(17)에서 모두 잘 알려진 아티팩트는 크기 호출 동안 전기 전형체에서 관찰될 수 있다(도4). 더듬 피크는 무시해야 하지만 단일 베이스 쌍으로 분리된 분할 피크의 경우 다운스트림 응용 프로그램에 대해 더 긴 피크를 일관되게 선택해야 합니다. 더욱이, 특정 VNTR loci의 부족을 나타내는 부재 피크는 드물지만 발생할 수 있으며, 이 경우 ‘0’의 반복 카운트가 할당되어야 한다. DNA가 추출되는 시작 배양이 순수하지 않은 경우(즉, 하나 이상의 Y. ruckeri 하위 유형을 포함함), 동일한 궤적/궤적의 상이한 골조에 해당하는 다중 키가 큰 피크는 CE 다음에 관찰될 수 있다. 이차 재배는 다시 입력을 위한 새로운 DNA 추출의 앞에 단 하나 식민지에서 그 때 능력을 발휘해야 합니다.
프로토콜에 명시된 바와 같이, PCR에 대한 템플릿 DNA는 기본적으로 Y. ruckeri의순수한 문화에서 추출되어야한다. 그러나 몇 가지 경우에, qPCR (Ct-값 & 27)에 의해 Y. ruckeri에 대한 양성 반응을 보인 계란 유체 샘플은 이전에 배양하지 않고, 템플릿으로 증가 된 양의 게놈 DNA (상업용 키트로 추출)를 사용하여 직접 MLVA를 성공적으로 입력했습니다. 이 접근법은 광범위하게 시험되거나 검증되지 않았지만, Y. ruckeri이외에 다양한 유기체로부터 DNA를 함유하는 복잡한 생물학적 행렬의 검사를 위한 이 MLVA 분석법의 가능성을 나타낸다.
여기에 제시된 전체 MLVA 타이핑 절차는 DNA 추출에서 후생동물 학적 평가에 이르기까지 단일 작업 일에서 완료 될 수 있습니다. 그러나, 조사된 샘플의 수는 DNA 추출, PCR 및 CE에 필요한 시간과 하위 선형 관계에 있으며, 따라서 여러 샘플을 동시에 실행할 때 방법이 훨씬 더 시간 효율적입니다. 이것은 그럼에도 불구하고 대부분의 실험실 기반 방법의 경우이며 Y. ruckeri의역학 하위 화를위한 도구로서 고해상도, 단순성 및 휴대성의 조합으로 이 MLVA 분석법을 이전에 출판 된 프로토콜 4보다 우수하게만듭니다. ,5. 또한 Y. ruckeri 혈청형14의제한된 역학 관련성을 확인하는 데 사용되었습니다.
484 Y. ruckeri 분리를 포함하는 포괄적인 MLVA 기반 인구 연구를 통해, 상피학 및 인구에 관하여 우리의 이해, spatiotemporal 기원 및 서식지 (호스트 물고기, 환경 등)의 범위에서 복구했습니다 이 중요한 어류 병원균의 구조는실질적으로 14증가되었다. MLVA 타이핑은 수십 년 동안 인위적으로 전파된 클론의 추적을 가능하게 했으며, 아마도 물고기의 수송과 국부적으로 제한된 균주의 식별을 통해 서열이 되었습니다. 더욱이, 박테리아의 몇몇 클론 복합체는 명확하게 특정 물고기 호스트에 있는 질병과 연관될 수 있는 동안 (무지개 송어와 대서양 연어, 각각), 그 외는 환경 근원 및/또는 임상적으로 영향을 받지 않는 물고기에서만 복구되었습니다 표본. 이 방법의 적용성은 감염 추적에 만 국한될 뿐만 아니라, 백신 개발, 위험 평가 및 국가 생물 안전의 유지 관리와 같은 잠재적 관련성에 대한 정보도 제공할 수 있다. 그것은 현재 노르웨이 양식에서 Y. ruckeri 진단을 조사 하기 위한 도구로 노르웨이 수의 학회에서 활성 사용.
The authors have nothing to disclose.
본 연구는 노르웨이 해산물 연구 기금, FHF (프로젝트 번호 901119 및 901505)에 의해 투자되었다. 우리는 방법 개발 중에 사용되는 세균 성 분리 및 샘플의 모든 기여자에게 감사드립니다.
22°C/15°C incubator | As preferred. | NA | |
5' Labeled Primer, 10K PMOL, Desalted, Dry | Thermo Fisher Scientific | 450007 | Sequences and labelling in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer. |
Agarose, universal, peqGOLD | VWR | 732-2789P/732-2788 | Used during gel electrophoresis. |
Avant 3500xL Genetic Analyzer | Thermo Fisher Scientific | A30469 | Used for capillary electrophoresis fragment analysis. |
BioNumerics7 modules | Applied Maths | NA | Used for generating Minimum spanning trees from MLVA data. |
Centrifuge(s) | As preferred. | NA | |
Custom DNA Oligo, 25N, Desalted, Dry | Thermo Fisher Scientific | A15612 | Sequences in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer. |
DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Fisher Scientific | R0611 | Loading dye used during gel electrophoresis. |
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | Centrifuge tubes used during DNA extraction. |
Freezer | As preferred. | NA | |
Fume cupboard | As preferred. | NA | |
Gel electrophoresis system | As preferred. | NA | |
GelRed Nucleic Acid Stain, 10,000X in water | Biotium | 41003 | Fluorescent nucleic acid dye used during gel electrophoresis. |
GeneMapper Software 5 | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | Used for reading electropherograms from capillary electrophoresis. |
GeneRuler 50 bp DNA Ladder, ready-to-use | Thermo Fisher Scientific | SM0373 | DNA ladder used during gel electrophoresis. |
GeneScan 600 LIZ dye Size Standard v2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4408399 | Size standard used during capillary electrophoresis. |
Heating block | As preferred. | NA | |
Hi-Di Formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320/4440753 | Deionized formamide used during capillary electrophoresis. Prepare working aliquouts. |
Milli-Q water | NA | NA | Purified water used during PCR and capillary electrophoresis. Standard recipe; produced in-house. |
Multiplex PCR Plus Kit | Qiagen | 206151/206152 | |
PCR thermal cycler | As preferred. | NA | |
POP-7 Polymer for 3500 Dx/3500xL Dx Genetic Analyzers | Thermo Fisher Scientific | A26077/4393713/4393709 | Separation matrix used during capillary electrophoresis. |
Pure culture Yersinia ruckeri | NA | NA | E.g. cryopreserved or fresh. |
RNase-free water | Qiagen | NA | In: Multiplex PCR Plus Kit |
Tris-borate-EDTA (TBE) buffer | NA | NA | Standard recipe; produced in-house. |
Trypsine soy agar/bovine blood agar | NA | NA | Standard recipe; produced in-house. |
UV-based gel imaging/visualisation system | As preferred. | NA | |
Vortexer | As preferred. | NA |