Multi-Locus değişken-sayı tandem-Repeat analiz (MLVA) tahlil burada sunulan ucuz, sağlam ve taşınabilir yüksek çözünürlüklü balık-patojen bakteri Yersinia ruckeriGenotipleme sağlar. Saf kültürlerden başlayarak, tahlil düşük uygulamalar için on-loci MLVA profilleri üretmek için Multiplex PCR ve kapiller Elektroforez istihdam.
Yersinia ruckeri , dünya çapındaki çiftlik salmonidlerin önemli bir patojen olduğunu, ancak bu bakterinin epizootiolojik araştırmalar (enfeksiyon izleme, vb.) için uygun basit araçlar eksik. Bir multi-Locus değişken-sayı tandem-Repeat Analizi (MLVA) tahlil bu nedenle kurtarılmış izolatlar yüksek çözünürlüklü Genotipleme için kolay erişilebilir ve belirsiz bir araç olarak geliştirilmiştir. Mlva tahlil için burada sunulan, DNA su içinde bakteri hücreleri kaynatma tarafından kültürlü Y. ruckeri örneklerden ayıklanır, PCR için şablon olarak süpernatant kullanımı izledi. Primer-çiftleri hedefleyen on değişken sayı tandem-REPEAT (VNTR) loci, Y. ruckeri genom boyunca serpiştirilmiş, aynı Bisiklet koşullarında çalışan 2 5-Plex PCR reaksiyonlar arasında eşit olarak dağıtılır. İleri astar üç floresan boya ile etiketlenmiş. Jel elektroforezi ile amplikon onayı takiben, PCR ürünleri seyreltilir ve kapiller elektroforezine maruz kalmaktadır. Elde edilen elektropherogram profillerinden, her VNTR loci temsil zirveleri boyutu denilen ve Silico içinde VNTR tekrarlama sayıları hesaplamak için istihdam. Sonuç olarak on haneli MLVA profilleri daha sonra küme analizi ile epizootiological değerlendirme sağlayan en az yayılan ağaçlar oluşturmak için kullanılır. Sayısal MLVA profilleri şeklinde son derece taşınabilir çıkış verileri, laboratuvarlar arasında hızla karşılaştırılabilir ve bir uzayotemporal bağlamda yerleştirilir. Kültürlü koloniden epizootiolojik değerlendirmeye kadar tüm prosedür, tek bir çalışma günü içinde 48 Y. ruckeri ısolates için tamamlanabilir.
Yersinia ruckeri, bir gram-negatif bakteri ve Yersiniaceae ailesinin üyesi, dünya çapında salmonid balıkların yersiniosis neden1. Bu kolayca agar medya birçok türleri üzerinde ekimi tarafından enfekte balık tanısı, ama yakın zamana kadar, küçük nüfus yapısı ve Y. ruckeri epizootiology dünya çapında ve farklı habitatları (ev sahibi türler, vb) ile ilgili bilinmektedir. Y. ruckeri için mevcut Serotiplendirme faydalı olmasında sistemleri tutarsız, karşılıklı uyumluluk eksikliği ve düşük epidemiyolojik çözünürlük sunar. Bakteri üzerinde bazı Moleküler çalışmalar yapılmıştır, çok yönlü sıralı yazma (mlst), pulsed-Field jel elektroforez (PFGE) veya tüm genom dizisi (WGS) analizi2,3,4 gibi teknikler istihdam edilmiştir ,5. Ancak, MLST rutin enfeksiyon izleme için yeterince yüksek bir çözünürlük sağlamaz, PFGE işçilik talep ederken ve laboratuvarlar arasında kolaylıkla taşınabilir olmayan sonuçlar üretir. WGS Analizi yakın bir nihai çözünürlük sağlamak olsa da, kurulması ve bu tür analizler uygulanması ön koşul teknik ve Biyoinformatik yetenekleri henüz laboratuvarların nispeten az sayıda sınırlı kalır.
Multi-Locus değişken sayı tandem-Repeat Analizi (mlva), bazı durumlarda neredeyse WGS Analizi6,7ile eşleşen bir genetik çözünürlük sunan basit ve kolayca erişilebilen bir moleküler yazma aracını temsil eder. Teknik, seçilen değişken sayı tandem-REPEAT (VNTR) loci ‘de tekrarlanan sayı varyasyonunu temel alarak, yüksek derecede taşınabilir olan çıkış verileriyle sonuçlanan, profilli yalıtılmaları çevrimiçi veritabanlarına ve laboratuvarlar arasında basit bir şekilde karşılaştırmayı yapıyor. Mlst, birçok bakteriyel patojenlerin epidemiyolojik yazımı için altın standardını sürdürmesine rağmen, artan sayıda çalışma mlva8,9,10‘ ın önemli ölçüde daha yüksek bir ayrımcılık gücünü tanımlar. Çeşitli protokoller de, Francella noatunensis, Edwardsiella sicicida ve renibacterium salmoninarum11,12gibi balık-patojenik bakterilerin hedefleme yayımlandı 13olmak üzere.
Burada sunulan on-loci MLVA protokolü, son zamanlarda geniş bir Y. ruckeri nüfus çalışması14için temel oluşturdu, agar-yetiştirilmiş koloniler, Multiplex PCR ve kapiller Elektroforez (CE) DNA ekstraksiyonu içerir, silico uygulamalarında aşağı aşağı takip. İncelenen her bir izole için, her ikisi de her biri VNTR bölgelerini hedefleyen beş floresan etiketli astar çifti (6FAM, NED veya VıC) içeren iki Multiplex PCRs, aynı koşullarda paralel olarak çalıştırılır. Jel elektroforezi (GE) ile PCR amplikonlar doğrulamasının ardından, PCR ürünleri CE analizinden önce seyreltilir ve ilgili VNTR loci temsil eden zirveler elde edilen elektropherogram dosyalarından boyut olarak adlandırılır. Küçük, sıra özgü tutarsızlıkları CE göç desenleri için hesap Locus özgü formüller ile birlikte, VNTR CE boyutu çağrıları sonra on basamaklı MLVA profillerine birleştirilmiş VNTR yineleme sayar hesaplamak için kullanılır. Bunlar, epizootiological değerlendirmeler için giriş olarak kullanılır (örneğin, en az yayılma ağacı (MST) diyagramlarında küme çözümlemesi tarafından).
Burada sunulan hem Multiplex PCRs yoksul şablon DNA kalitesi karşısında nispeten sağlam göründü, ancak PCR amplifikasyon eksikliği yine de zaman zaman son derece yüksek DNA konsantrasyonları ile şablonlar kullanırken gözlenen. Bu sorunlar, PCR öncesinde şablonları seyreltilerek kolayca çözülmüştür. Burada çalışan biri daha DNA ekstraksiyon için diğer yöntemler de kullanılabilir (örneğin, ticari kitleri).
Her bir Multiplex PCR reaksiyonundan beş amplikonlar bekleniyor rağmen, beş görsel olarak ayırt bantları her zaman Ge beklenen olmamalıdır, bazı (farklı etiketli) aynı reaksiyon içinde VNTR loci çakışan boyut aralıkları vardır. 60 min son PCR uzatma süresi gerekirse kısaltılabilir, ancak muhtemelen sonraki CE elektrophergramında bölünmüş doruklara sonuçlanan artışa neden olacaktır (aşağıya bakın). Özellikle, GE adımının amacı, PCR amplicons nitel doğrulama için tamamen olduğu gibi, çalışma süresi, voltaj ve/veya jel tarifi tercih edilebilir olarak ayarlanabilir. Özellikle zayıf bantlar GE tarafından gözlemlenirse, CE ‘den önce bu numunelerin seyreltme faktörünü azaltmanız tavsiye edilebilir.
Burada açıklanan CE Protokolü belirli bir ticari kapiller Elektroforez aparatı üzerinde çalıştırılırken ( malzeme tablosunabakın), farklı CE sistemleri farklı örnek gereksinimlere sahip olabilir, bu da protokole bazı değişiklikler isteyebilir . Parça analizi için uygun reaktifler/ekipmanlar, kalibrasyon vb. yönergeleri için ilgili CE sistemi üreticisinin kılavuzuna bakın. Ayrıca, CE sırasında gözlenen önyargılı amplikon hareketlilik desenlerinin, CE sistemleri ve/veya makinelerde daha önce diğer mlva protokolleri için belgelendiği gibi, göreceli olarak farklılık göstermesi olasılığı vardır15,16. Burada son (yuvarlatılmış) VNTR yineleme sayar etkilenen bir ölçüde oluşsa, bu Locus özgü değişkenler anlamına gelir s ve ı (Tablo 1), VNTR yineleme sayar belirlemek için kullanılan yeniden kalibre edilmelidir. Bu, GULLA ve al. 2018 tarafından açıklandığı gibi, doğru sıra boyutlarını CE boyutu çağrılarına karşı karşılaştırarak grafiklerde doğrusalregresyon içerir.
Bölünmüş zirveler ve kekeme zirveleri, CE tabanlı MLVA yazarak17, hem tanınmış eserler, boyut arama sırasında elektrophergramlar görülebilir (Şekil 4). Kekeme zirveleri gözardı edilirken, tek bir temel çifti ile ayrılan bölünmüş zirveler durumunda uzun zirve sürekli olarak aşağı akım uygulamaları için seçilmelidir. Dahası, belirli VNTR loci eksikliği gösteren yok zirveler nadirdir, ancak ortaya çıkabilir, bu durumda ‘ 0 ‘ bir yineleme sayısı atanmalıdır. DNA ayıklandığı başlangıç kültürü saf değilse (yani, birden fazla Y. ruckeri Sub-Type içerir), aynı Locus/loci farklı allaklarına karşılık gelen birden fazla uzun DORUKLARDA CE izlenebilir. Daha sonra yeniden yazarak yeni DNA ekstraksiyonu öncesinde tek kolonilerden ikincil yetiştirmeler yapılmalıdır.
Protokolde belirtildiği gibi, PCR için şablon DNA ‘Sı, varsayılan olarak Y. ruckeri‘nin saf kültürlerinden çıkarılır. Ancak, birkaç olguda, Y. ruckeri Için qPCR (CT-değerler < 27) pozitif test edilen yumurta sıvısı numuneleri, önceden kültür olmaksızın, daha yüksek miktarda genomik DNA (ticari kit ile ayıklanan) ile şablon olarak doğrudan yazılı olarak mlva ile başarıyla yazıldı. Bu yaklaşım kapsamlı bir şekilde test edilmemiş ya da doğrulanmamış olsa da, Y. ruckeriek olarak farklı organizmaların BIR dizi DNA içeren karmaşık biyolojik Matrislerin incelenmesi IÇIN bu mlva tahlil potansiyelini gösterir.
Burada sunulan tüm MLVA yazma prosedürü, DNA Ekstraksiyonunda epizootiolojik değerlendirmeye kadar, tek bir çalışma gününde tamamlanabilir. Ancak, incelenen numunelerin sayısı DNA ekstraksiyon, PCR ve CE için gerekli olan zaman ile bir alt ilişkidir ve bu nedenle birden fazla numune aynı anda çalışırken çok daha verimli bir yöntemdir. Bu yine de çoğu laboratuar tabanlı yöntemler için durumda, ve Y. ruckeriepidemiyolojik alt yazma için bir araç olarak, yüksek çözünürlüklü kombinasyonu, basitlik ve taşınabilirlik bu mlva tahlil daha önce yayımlanan protokolleri üstün yapar4 ,5. Ayrıca Y. ruckeri Serotiplendirme faydalı olmasında14‘ ün sınırlı epidemiyolojik alaka doğrulamak için kullanılmıştır.
Kapsamlı bir mlva tabanlı nüfus çalışma 484 Y. ruckeri ısolates içeren bir dizi zamanmekansal kökenleri ve habitatlar (ana balık, çevre, vb), bizim anlayış epizootiology ve nüfus ile ilgili kurtarılan aracılığıyla Bu önemli balık patojen yapısı büyük ölçüde arttı14. MLVA yazarak klonların takibine, onlarca yıldır antropojenik olarak yayılan, muhtemelen balıkların taşınması ve yerel olarak sınırlı suşların tanımlanması etkinleşir. Dahası, bakterinin bazı klonal kompleksleri açıkça özellikle balık konaklarında (gökkuşağı alabalıkları ve Atlantik somon, sırasıyla) hastalığı ile ilişkili olabilir, diğerleri sadece çevresel kaynaklardan ve/veya klinik olarak etkilenmez balık kurtarıldı Örnek. Yöntemin uygulanabilirliği, böylece sadece enfeksiyon izleme ile sınırlı değildir, aynı zamanda aşı gelişimi, risk değerlendirmesi ve ulusal Biyogüvenlik bakımı gibi potansiyel alaka bilgileri de sağlayabilir. Şu anda Norveçli veteriner Enstitüsü ‘nde, Norveç su ürünleri alanında Y. ruckeri tanımları araştırma aracı olarak aktif kullanımda.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışmada Norveç deniz ürünleri araştırma fonu, FHF (Proje No. 901119 ve 901505) tarafından finanse edilmiştir. Yöntem geliştirme sırasında kullanılan bakteriyel izolatlar ve numunelerin tüm katılımcılara teşekkür etmek istiyoruz.
22°C/15°C incubator | As preferred. | NA | |
5' Labeled Primer, 10K PMOL, Desalted, Dry | Thermo Fisher Scientific | 450007 | Sequences and labelling in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer. |
Agarose, universal, peqGOLD | VWR | 732-2789P/732-2788 | Used during gel electrophoresis. |
Avant 3500xL Genetic Analyzer | Thermo Fisher Scientific | A30469 | Used for capillary electrophoresis fragment analysis. |
BioNumerics7 modules | Applied Maths | NA | Used for generating Minimum spanning trees from MLVA data. |
Centrifuge(s) | As preferred. | NA | |
Custom DNA Oligo, 25N, Desalted, Dry | Thermo Fisher Scientific | A15612 | Sequences in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer. |
DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Fisher Scientific | R0611 | Loading dye used during gel electrophoresis. |
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | Centrifuge tubes used during DNA extraction. |
Freezer | As preferred. | NA | |
Fume cupboard | As preferred. | NA | |
Gel electrophoresis system | As preferred. | NA | |
GelRed Nucleic Acid Stain, 10,000X in water | Biotium | 41003 | Fluorescent nucleic acid dye used during gel electrophoresis. |
GeneMapper Software 5 | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | Used for reading electropherograms from capillary electrophoresis. |
GeneRuler 50 bp DNA Ladder, ready-to-use | Thermo Fisher Scientific | SM0373 | DNA ladder used during gel electrophoresis. |
GeneScan 600 LIZ dye Size Standard v2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4408399 | Size standard used during capillary electrophoresis. |
Heating block | As preferred. | NA | |
Hi-Di Formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320/4440753 | Deionized formamide used during capillary electrophoresis. Prepare working aliquouts. |
Milli-Q water | NA | NA | Purified water used during PCR and capillary electrophoresis. Standard recipe; produced in-house. |
Multiplex PCR Plus Kit | Qiagen | 206151/206152 | |
PCR thermal cycler | As preferred. | NA | |
POP-7 Polymer for 3500 Dx/3500xL Dx Genetic Analyzers | Thermo Fisher Scientific | A26077/4393713/4393709 | Separation matrix used during capillary electrophoresis. |
Pure culture Yersinia ruckeri | NA | NA | E.g. cryopreserved or fresh. |
RNase-free water | Qiagen | NA | In: Multiplex PCR Plus Kit |
Tris-borate-EDTA (TBE) buffer | NA | NA | Standard recipe; produced in-house. |
Trypsine soy agar/bovine blood agar | NA | NA | Standard recipe; produced in-house. |
UV-based gel imaging/visualisation system | As preferred. | NA | |
Vortexer | As preferred. | NA |