Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analyse des Fischpathogenen Bakteriums Yersinia ruckeri durch Multiplex-PCR und Kapillarelektrophorese
Summary
Der hier vorgestellte Multi-Locus Variable-number Tandem-Repeat Analysis (MLVA)-Assay ermöglicht eine kostengünstige, robuste und tragbare hochauflösende Genotypisierung des fischpathogenen Bakteriums Yersinia ruckeri. Ausgehend von reinen Kulturen verwendet der Assay Multiplex-PCR- und Kapillarelektrophorese, um zehn Loci MLVA-Profile für nachgelagerte Anwendungen zu erstellen.
Abstract
Yersinia ruckeri ist ein wichtiger Erreger von Zuchtsalmoniden weltweit, aber einfache Werkzeuge, die für epizootiologische Untersuchungen (Infektionsverfolgung, etc.) dieses Bakteriums geeignet sind, haben gefehlt. Ein Multi-Locus-System zur Variablenzahl (MLVA) wurde daher als leicht zugängliches und eindeutiges Werkzeug zur hochauflösenden Genotypisierung von wiedergewonnenen Isolaten entwickelt. Für den hier vorgestellten MLVA-Assay wird DNA aus kultivierten Y. ruckeri Proben extrahiert, indem Bakterienzellen in Wasser gekocht werden, gefolgt von der Verwendung von Überstand als Vorlage für PCR. Primer-Paare, die auf zehn Variable-Number Tandem-Repeat (VNTR) loci abzielen, die im gesamten Y. ruckeri-Genom durchsetzt sind, sind gleichmäßig auf zwei fünfplexe PCR-Reaktionen verteilt, die unter identischen Zyklusbedingungen laufen. Vorwärtsprimer sind mit einem der drei fluoreszierenden Farbstoffe gekennzeichnet. Nach Amplicon-Bestätigung durch Gelelektrophorese werden PCR-Produkte verdünnt und einer kapillaren Elektrophorese unterzogen. Aus den resultierenden Elektropherogrammprofilen werden Spitzen, die die einzelnen VNTR-Loci darstellen, größenmäßig bezeichnet und zur Berechnung der VNTR-Wiederholungszahlen in Silico verwendet. Daraus resultierende zehnstellige MLVA-Profile werden dann verwendet, um minimale Spannbäume zu generieren, die eine epizootiologische Auswertung durch Clusteranalyse ermöglichen. Die hochportablen Ausgabedaten in Form von numerischen MLVA-Profilen können schnell über Labore hinweg verglichen und in einen raumzeitlichen Kontext gestellt werden. Das gesamte Verfahren von der Kulturkolonie bis zur epizootiologischen Bewertung kann für bis zu 48 Y. ruckeri Isolate innerhalb eines einzigen Arbeitstages abgeschlossen werden.
Introduction
Yersinia ruckeri, ein gramnegatives Bakterium und Mitglied der Familie der Yersiniaceae, verursacht Yersiniose bei Zuchtlachsfischen weltweit1. Es wird leicht von infizierten Fischen durch Anbau auf vielen Arten von Agar-Medien diagnostiziert, aber bis vor kurzem war wenig über die Populationsstruktur und Epizootiologie von Y. ruckeri auf der ganzen Welt und in verschiedenen Lebensräumen (Wirtsarten, etc.) bekannt. Bestehende Serotypisierungssysteme für Y. ruckeri sind inkonsistent, haben keine gegenseitige Kompatibilität und bieten eine geringe epidemiologische Auflösung. Einige molekulare Studien am Bakterium wurden durchgeführt, wobei Techniken wie Multilocus-Sequenztypisierung (MLST), Gepulste Gelelektrophorese (PFGE) oder Ganzgenomsequenzanalyse (WGS)2,3,4 ,5. MLST bietet jedoch keine ausreichend hohe Auflösung für die routinemäßige Infektionsverfolgung, während PFGE arbeitslastig ist und Ergebnisse liefert, die nicht ohne weiteres über Labors hinweg tragbar sind. Während die WGS-Analyse eine nahezu endgültige Lösung bringen würde, würde die Einrichtung und Durchführung solcher Analysen technische und bioinformatische Fähigkeiten voraussetzungen, die noch auf eine relativ kleine Anzahl von Laboratorien beschränkt bleiben.
Die Multi-Locus-Variablen-Zahlen-Tandem-Wiederholungsanalyse (MLVA) stellt ein einfaches und leicht zugängliches molekulares Typisierungswerkzeug dar, das in einigen Fällen eine genetische Lösung bietet, die fast der der WGS-Analyse6,7entspricht. Die Technik basiert auf der Wiederholungszahlvariation in ausgewählten VNTR-Loci (Variable Number Tandem-Repeat), was zu Ausgabedaten führt, die stark transportabel sind, wodurch der Vergleich von profilierten Isolaten mit Online-Datenbanken und über Labors hinweg einfach ist. Obwohl MLST nach wie vor der Goldstandard für die epidemiologische Typisierung vieler bakterieller Krankheitserreger ist, identifizieren immer mehr Studien eine signifikant höhere diskriminierende Leistung von MLVA8,9,10. Mehrere Protokolle wurden auch veröffentlicht, die auf fischpathogene Bakterien abzielen, wie Francisella noatunensis, Edwardsiella piscicida und Renibacterium salmoninarum11,12, 13.
Das hier vorgestellte MLVA-Protokoll von ten loci, das vor kurzem die Grundlage für eine umfangreiche Y. ruckeri Populationsstudie14bildete, beinhaltet die Extraktion von DNA aus agar-kultivierten Kolonien, Multiplex-PCR und Kapillarelektrophorese (CE), gefolgt von downstream in Silico-Anwendungen. Für jedes untersuchte Isolat werden zwei Multiplex-PCRs, die beide fünf fluoreszierend markierte Primerpaare (6FAM, NED oder VIC) enthalten, jeweils für einzelne VNTR-Regionen parallel unter identischen Bedingungen ausgeführt. Nach der Überprüfung von PCR-Amplicons durch Gelelektrophorese (GE) werden PCR-Produkte vor der CE-Analyse verdünnt, und Spitzen, die die jeweiligen VNTR-Loci darstellen, werden aus den resultierenden Elektropherogramm-Dateien größenmäßig bezeichnet. Zusammen mit ortsspezifischen Formeln, die kleinere, sequenzspezifische Abweichungen in CE-Migrationsmustern berücksichtigen, werden dann VNTR CE-Größenaufrufe zur Berechnung von VNTR-Wiederholungszahlen verwendet, die in zehnstellige MLVA-Profile verkettet sind. Diese werden als Eingabe für epizootiologische Auswertungen verwendet (z. B. durch Clusteranalyse in MST-Diagrammen (Minimum Spanning Tree).
Protocol
Representative Results
Discussion
Beide multiplexPCRs, die hier vorgestellt wurden, erschienen angesichts der schlechten DNA-Qualität der Schablone relativ robust, aber der Mangel an PCR-Verstärkung wurde dennoch gelegentlich beobachtet, wenn Vorlagen mit extrem hohen DNA-Konzentrationen verwendet wurden. Diese Probleme wurden leicht gelöst, indem die Vorlagen vor pcR verdünnt wurden. Es können auch andere Methoden zur DNA-Extraktion als die hier verwendeten verwendet werden (z. B. kommerzielle Kits).
Obwohl von jeder Multiplex-PCR-Reaktion fünf Amplicons erwartet werden, sollten von GE nicht immer fünf visuell unterscheidbare Bänder erwartet werden, da einige (anders beschriftete) VNTR-Loci innerhalb derselben Reaktion überlappende Größenbereiche aufweisen. Die endgültige PCR-Verlängerungszeit von 60 min kann bei Bedarf verkürzt werden, wird aber wahrscheinlich zu einem erhöhten Auftreten von Splitpeaks in nachfolgenden CE-Elektropherogrammen führen (siehe unten). Da der Zweck des GE-Schritts ausschließlich der qualitativen Überprüfung von PCR-Amplicons dient, können die Laufzeit, die Spannung und/oder das Gelrezept wie gewünscht angepasst werden. Wenn GE besonders schwache Bänder beobachtet, kann es ratsam sein, den Verdünnungsfaktor dieser Proben vor CE zu reduzieren.
Während das hier beschriebene CE-Protokoll auf einem bestimmten kommerziellen Kapillarelektrophoresegerät ausgeführt wurde (siehe Materialtabelle),können verschiedene CE-Systeme unterschiedliche Probenanforderungen aufweisen, was wiederum zu einigen Änderungen am Protokoll führen kann. . Hinweise zur Fragmentanalyse finden Sie im Handbuch des jeweiligen CE-Systemherstellers. Es besteht auch die Möglichkeit, dass sich die während des CE beobachteten voreingenommenen Amplicon-Mobilitätsmuster relativ erweise zwischen CE-Systemen und/oder Maschinen unterscheiden, wie zuvor für andere MLVA-Protokolle15,16dokumentiert wurde. Wenn die stritten den letzten (gerundeten) VNTR-Wiederholungszähler, so müssen die ortsspezifischen Variablen s und i (Tabelle 1), die zur Bestimmung der VNTR-Wiederholungszahlen verwendet werden, neu kalibriert werden. Dies beinhaltet eine lineare Regression auf Diagrammen, die genaue Sequenzgrößen mit CE-Größenaufrufen vergleichen, wie von Gulla et al. 201814beschrieben.
Split-Peaks und Stotterspitzen, beides bekannte Artefakte in CE-basierter MLVA-Typisierung17, können bei Elektropherogrammen während des Größenaufrufs beobachtet werden (Abbildung 4). Während Stotterspitzen unberücksichtigt bleiben sollten, sollte der längere Peak bei geteilten Spitzen, die durch ein einzelnes Basispaar getrennt sind, konsequent für nachgeschaltete Anwendungen ausgewählt werden. Darüber hinaus sind fehlende Spitzen, die auf das Fehlen bestimmter VNTR-Loci hinweisen, selten, können jedoch auftreten, wobei eine Wiederholungszahl von ‘0’ zugewiesen werden sollte. Wenn die Ausgangskultur, aus der DNA extrahiert wird, nicht rein ist (d.h. mehr als einen Y. ruckeri Subtyp enthält), können nach CE mehrere hohe Spitzen beobachtet werden, die verschiedenen Allelen desselben Lokus/Loci entsprechen. Sekundäre Kultivierungen müssen dann aus einzelnen Kolonien durchgeführt werden, bevor neue DNA-Extraktion für die Wiedertypisierung erfolgt.
Wie im Protokoll angegeben, sollte Die Vorlagen-DNA für PCR standardmäßig aus reinen Kulturen von Y. ruckeriextrahiert werden. In einigen Fällen wurden jedoch eifluidische Proben, die positiv auf Y. ruckeri durch qPCR (Ct-Werte < 27) getestet wurden, erfolgreich MLVA direkt, ohne vorherige Kultivierung, unter Verwendung einer erhöhten Menge an genomischer DNA (extrahiert mit kommerziellem Kit) als Vorlage. Obwohl dieser Ansatz nicht ausgiebig getestet oder verifiziert wurde, weist er auf das Potenzial dieses MLVA-Assays zur Untersuchung komplexer biologischer Matrizen hin, die neben Y. ruckeriauch DNA-haltige DNA aus einer Reihe verschiedener Organismen enthalten.
Das gesamte hier vorgestellte MLVA-Typisierungsverfahren, von der DNA-Extraktion bis zur epizootiologischen Auswertung, kann an einem einzigen Arbeitstag abgeschlossen werden. Die Anzahl der untersuchten Proben steht jedoch in einer sublinearen Beziehung zur Zeit, die für DNA-Extraktion, PCR und CE benötigt wird, und die Methode ist daher viel zeiteffizienter, wenn mehrere Proben gleichzeitig ausgeführt werden. Dies ist jedoch der Fall für die meisten Labor-basierten Methoden, und als Werkzeug für die epidemiologische Subtypisierung von Y. ruckerimacht die Kombination aus hoher Auflösung, Einfachheit und Portabilität diesen MLVA-Assay den zuvor veröffentlichten Protokollen überlegen4 ,5. Es wurde auch verwendet, um die begrenzte epidemiologische Relevanz von Y. ruckeri serotyping14zu überprüfen.
Durch eine umfassende MLVA-basierte Populationsstudie mit 484 Y. ruckeri Isolaten, die aus einer Reihe von raumzeitlichen Ursprüngen und Lebensräumen (Wirtsfische, Umwelt usw.) gewonnen wurden, haben wir verständnisvolle Informationen über die Epizootiologie und die Population Struktur dieses wichtigen Fischpathogens wurde deutlich erhöht14. Die MLVA-Typisierung ermöglichte die Rückverfolgung von Klonen, die über Jahrzehnte anthropogen verbreitet wurden, vermutlich durch den Transport von Fischen, sowie die Identifizierung lokal begrenzter Stämme. Während einige klonale Komplexe des Bakteriums eindeutig mit Krankheiten in Verbindung gebracht werden könnten, insbesondere mit Fischwirten (Regenbogenforelle bzw. Atlantischer Lachs), wurden andere nur aus Umweltquellen und/oder klinisch nicht betroffenen Fischen geborgen. Exemplare. Die Anwendbarkeit des Verfahrens beschränkt sich daher nicht nur auf die Rückverfolgung von Infektionen, da sie auch Informationen von potenzieller Relevanz liefern kann, z. B. für die Entwicklung von Impfstoffen, die Risikobewertung und die Aufrechterhaltung der nationalen Biosicherheit. Es ist derzeit im aktiven Einsatz am Norwegischen Veterinärinstitut als Werkzeug zur Untersuchung von Y. ruckeri Diagnosen in der norwegischen Aquakultur.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die vorliegende Studie wurde vom Norwegian Seafood Research Fund, FHF (Projekt-Nr. 901119 und 901505) finanziert. Wir möchten uns bei allen Mitwirkenden von Bakteriellen Isolaten und Proben bedanken, die bei der Methodenentwicklung verwendet werden.
Materials
| 22°C/15°C incubator | As preferred. | NA | |
| 5' Labeled Primer, 10K PMOL, Desalted, Dry | Thermo Fisher Scientific | 450007 | Sequences and labelling in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer. |
| Agarose, universal, peqGOLD | VWR | 732-2789P/732-2788 | Used during gel electrophoresis. |
| Avant 3500xL Genetic Analyzer | Thermo Fisher Scientific | A30469 | Used for capillary electrophoresis fragment analysis. |
| BioNumerics7 modules | Applied Maths | NA | Used for generating Minimum spanning trees from MLVA data. |
| Centrifuge(s) | As preferred. | NA | |
| Custom DNA Oligo, 25N, Desalted, Dry | Thermo Fisher Scientific | A15612 | Sequences in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer. |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Fisher Scientific | R0611 | Loading dye used during gel electrophoresis. |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | Centrifuge tubes used during DNA extraction. |
| Freezer | As preferred. | NA | |
| Fume cupboard | As preferred. | NA | |
| Gel electrophoresis system | As preferred. | NA | |
| GelRed Nucleic Acid Stain, 10,000X in water | Biotium | 41003 | Fluorescent nucleic acid dye used during gel electrophoresis. |
| GeneMapper Software 5 | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | Used for reading electropherograms from capillary electrophoresis. |
| GeneRuler 50 bp DNA Ladder, ready-to-use | Thermo Fisher Scientific | SM0373 | DNA ladder used during gel electrophoresis. |
| GeneScan 600 LIZ dye Size Standard v2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4408399 | Size standard used during capillary electrophoresis. |
| Heating block | As preferred. | NA | |
| Hi-Di Formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320/4440753 | Deionized formamide used during capillary electrophoresis. Prepare working aliquouts. |
| Milli-Q water | NA | NA | Purified water used during PCR and capillary electrophoresis. Standard recipe; produced in-house. |
| Multiplex PCR Plus Kit | Qiagen | 206151/206152 | |
| PCR thermal cycler | As preferred. | NA | |
| POP-7 Polymer for 3500 Dx/3500xL Dx Genetic Analyzers | Thermo Fisher Scientific | A26077/4393713/4393709 | Separation matrix used during capillary electrophoresis. |
| Pure culture Yersinia ruckeri | NA | NA | E.g. cryopreserved or fresh. |
| RNase-free water | Qiagen | NA | In: Multiplex PCR Plus Kit |
| Tris-borate-EDTA (TBE) buffer | NA | NA | Standard recipe; produced in-house. |
| Trypsine soy agar/bovine blood agar | NA | NA | Standard recipe; produced in-house. |
| UV-based gel imaging/visualisation system | As preferred. | NA | |
| Vortexer | As preferred. | NA |
References
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