Мульти-локус переменный номер Тандем-повтор Анализ рыбы-патогенной бактерии Yersinia ruckeri по multiplex PCR и Капиллярэлектрорез
Summary
Multi-Locus переменный номер тандем-повторный анализ (MLVA) анализ представлен здесь позволяет недорогой, надежный и портативный генотипирования высокого разрешения рыбы патогенной бактерии Yersinia ruckeri. Начиная с чистых культур, в ассейном используются мультиплексп ПЦР и капиллярный электрофорез для получения десятилокий профилей MLVA для приложений ниже по течению.
Abstract
Yersinia ruckeri является важным патогеном выращиваемых лососевых во всем мире, но простые инструменты, пригодные для эпизоотиологических исследований (отслеживание инфекции и т.д.) этой бактерии не хватает. Таким образом, анализ тандема с переменным числом Multi-Locus (MLVA) был разработан как легкодоступный и недвусмысленный инструмент для генотипирования восстановленных изолятов с высоким разрешением. Для анализа MLVA представлено здесь, ДНК извлекается из культивированных образцов Y. ruckeri путем кипячения бактериальных клеток в воде, а затем использование супернатанта в качестве шаблона для ПЦР. Primer-пары ориентации десять переменных числа тандем-повторить (VNTR) локусов, перемежаются по всему геному Y. ruckeri, распределяются поровну между двумя пятью plex PCR реакций работает в идентичных условиях езды на велосипеде. Передние грунтовки помечены любым из трех флуоресцентных красителей. После подтверждения амплитона гелем электрофорезом продукты ПЦР разбавляются и подвергаются капиллярному электрофорезу. Из полученных профилей электроферограммы пики, представляющие каждый из локусов VNTR, называются и используются для расчета повторных отсчетов VNTR в силико. В результате десятизначные профили MLVA затем используются для создания минимального охватывающего деревьев, позволяющих эпизоотиологические оценки кластерного анализа. Высоко портативные выходные данные, в виде численных профилей MLVA, можно быстро сравнить между лабораториями и поместить в пространственно-временном контексте. Вся процедура от культивируемой колонии до эпизоотиологической оценки может быть завершена на срок до 48 Y. ruckeri изолятов в течение одного рабочего дня.
Introduction
Yersinia ruckeri, Грамм-отрицательная бактерия и член семьи Yersiniaceae, вызывает yersiniosis в выращиваемых лососевых рыб во всем мире1. Он легко диагностируется от инфицированных рыб путем выращивания на многих видах агар средств массовой информации, но до недавнего времени, мало было известно о структуре населения и эпизоотиологии Y. ruckeri по всему миру и в различных средах обитания (принимающих видов и т.д.). Существующие серотипные системы для Y. ruckeri несовместимы, не имеют взаимной совместимости и предлагают низкое эпидемиологическое разрешение. Некоторые молекулярные исследования на бактерии были проведены, используя методы, такие как Multilocus последовательности ввода (MLST), Пульс-поле гель электрофорез (PFGE) или последовательность всего генома (WGS) анализ2,3,4 ,5. Тем не менее, MLST не обеспечивает достаточно высокое разрешение для рутинного отслеживания инфекции, в то время как PFGE является трудом требовательных и производит результаты, которые не легко портативных через лаборатории. Хотя анализ РГС обеспечит почти окончательное решение, создание и осуществление таких анализов будет предпосылкой технических и биоинформатических возможностей, которые, тем не менее, по-прежнему ограничиваются относительно небольшим числом лабораторий.
Multi-locus переменный номер тандем-повторный анализ (MLVA) представляет собой простой и легко доступный молекулярный инструмент ввода, который предлагает генетическое разрешение в некоторых случаях почти соответствует анализу WGS6,7. Метод основан на повторном изменении числа в выбранных парадем-повторении переменного числа (VNTR), в результате чего выходные данные, которые очень переносимы, что делает сравнение профилированных изолятов по отношению к онлайновым базам данных и через лаборатории простым. Хотя MLST остается золотым стандартом для эпидемиологического ввода многих бактериальных патогенов, все большее число исследований определить значительно выше дискриминационной мощности MLVA8,9,10. Несколько протоколов были также опубликованы ориентации рыбы патогенных бактерий, таких как Francisella noatunensis, Edwardsiella piscicida и Renibacterium salmoninarum11,12, 13.
Десять-loci MLVA протокол, представленный здесь, который недавно лег в основу обширного исследования Y. ruckeri населения14, включает в себя извлечение ДНК из агар-культивируемых колоний, мультиплекс ПЦР и капиллярного электрофореза (CE), затем вниз по течению в силико приложений. Для каждого исследованного изолята два пХР мультиплекса, которые содержат пять флуоресцентно обозначенных грунтовок (6FAM, NED или VIC), каждая из которых ориентирована на отдельные регионы ВНТР, работают параллельно в одинаковых условиях. После проверки ампликонов ПЦР с помощью гелевого электрофорезиса (GE) продукты ПЦР разбавляются до анализа СЕ, а пики, представляющие соответствующие локи VNTR, называются из полученных электроферограмм. Вместе с локусовыми формулами, учитывающими незначительные, специфические последовательность расхождения в миграционных моделях CE, вызовы размера VNTR CE затем используются для расчета повторных отсчетов VNTR, которые сливаются в десятизначные профили MLVA. Они используются в качестве входных данных для эпизоотиологических оценок (например, кластерного анализа в диаграммах минимального охвата дерева (MST).
Protocol
Representative Results
Discussion
Оба мультиплекса PCRs представлены здесь оказались относительно надежными в условиях плохого качества ДНК шаблона, но отсутствие усиления ПЦР, тем не менее, иногда наблюдалось при использовании шаблонов с чрезвычайно высокой концентрацией ДНК. Эти проблемы были легко решены путем разбавления шаблонов до ПЦР. Другие методы извлечения ДНК, чем те, которые используются здесь, также могут быть использованы (например, коммерческие наборы).
Хотя от каждой реакции ПЦР ожидается пять ампликонов, от GE не всегда следует ожидать пяти эффектных диапазонов, так как некоторые (по-разному обозначенные) локи VNTR в пределах одной реакции имеют перекрывающиеся диапазоны размеров. Окончательное время расширения ПЦР на 60 мин может быть сокращено при необходимости, но, скорее всего, приведет к увеличению возникновения сплит пиков в последующих электроферограммах CE (см. ниже). Примечательно, что, поскольку цель шага GE заключается исключительно в качественной проверке ампликонов ПЦР, время выполнения, напряжение и/или рецепт геля могут быть скорректированы в качестве предпочтительного. Если GE наблюдает особенно слабые полосы, то может быть целесообразным уменьшить коэффициент разбавления этих образцов до CE.
В то время как описанный здесь протокол CE был запущен на конкретном коммерческом аппарате электрофореза капилляров (см. Таблицаматериалов), различные системы CE могут иметь различные требования к выборке, что, в свою очередь, может вызвать некоторые изменения в протоколе . Для анализа фрагментов в руководстве соответствующего производителя системы CE можно усмотреть руководство по соответствующим реагентам/оборудованию, калибровке и т.д. Существует также возможность того, что предвзятые модели мобильности ампликонов, наблюдаемые во время CE, могут отличаться, относительно, в системах ce и/или машинах, как это было ранее задокументировано для других протоколов MLVA15,16. Если происходит в той степени, где окончательные (округленные) VNTR повторных отсчетов становятся затронутыми, это означает, что локус конкретных переменных s и i (таблица 1), используется для определения VNTR повторных отсчетов, должны быть перекалиброваны. Это включает в себя линейную регрессию на участках сравнения точных размеров последовательности по сравнению с CE размер звонки, как описано Gulla et al. 201814.
Сплит пики и пики заикания, как известные артефакты в CE на основе MLVA набрав17, можно наблюдать в электроферограммах во время вызова размера (Рисунок 4). В то время как пики заикания следует игнорировать, более длинный пик должен последовательно побираться для приложений вниз по течению в случае разделенных пиков, разделенных одной базовой парой. Кроме того, отсутствующие пики, указывающие на отсутствие конкретных локусов VNTR редки, но могут возникнуть, и в этом случае следует назначить повторный подсчет ‘0’. Если начальная культура, из которой извлекается ДНК, не является чистой (т.е. содержит более одного подтипа Y. ruckeri), то после CE могут наблюдаться несколько высоких пиков, соответствующих различным аллелям одного и того же локуса/локусов. Вторичное культивирование должно быть выполнено из отдельных колоний до новой добычи ДНК для повторного ввода.
Как указано в протоколе, шаблон ДНК для ПЦР должен по умолчанию быть извлечен из чистых культур Y. ruckeri. В некоторых случаях, однако, образцы яичной жидкости, положительные для Y. ruckeri qPCR (Ct-values zlt; 27) были успешно MLVA набраны непосредственно, без предварительного культивирования, используя увеличенное количество геномной ДНК (извлеченной с коммерческим комплектом) в качестве шаблона. Хотя этот подход не был тщательно протестирован и не проверен, он указывает на потенциал этого анализа MLVA для изучения сложных биологических матриц, содержащих ДНК из целого ряда различных организмов в дополнение к Y. ruckeri.
Вся представленная здесь процедура ввода MLVA, от экстракции ДНК до эпизоотиологической оценки, может быть завершена за один рабочий день. Тем не менее, количество исследованных образцов находится в сублинейной связи со временем, необходимым для извлечения ДНК, ПЦР и CE, и поэтому метод является гораздо более эффективным временем при запуске нескольких образцов одновременно. Это, тем не менее, относится к большинству лабораторных методов, и в качестве инструмента для эпидемиологического субтипирования Y. ruckeri, сочетание высокого разрешения, простоты и портативности делает этот анализ MLVA выше ранее опубликованных протоколов4 ,5. Он также был использован для проверки ограниченной эпидемиологической значимости Y. ruckeri серотипирования14.
Благодаря комплексному исследованию популяции на основе MLVA с участием 484 Y. ruckeri изолятов, извлеченных из целого ряда пространственно-временное происхождение и места обитания (рыба-хозяин, окружающая среда и т.д.), наше понимание в отношении эпизоотиологии и населения структура этого важного патогена рыбы была существенно увеличена14. Типирование MLVA позволило отслеживать клонов, распространяемых антропогенно на протяжении десятилетий, предположительно путем транспортировки рыбы, а также идентификацию местных штаммов. Кроме того, в то время как некоторые клональные комплексы бактерии могут быть явно связаны с болезнями, в частности, с рыбой (радужная форель и атлантический лосось, соответственно), другие были восстановлены только из экологических источников и/или клинически незатронутых рыб Образцов. Таким образом, применимость метода не ограничивается лишь отслеживанием инфекции, поскольку она может также предоставлять информацию, имеющих потенциальную значимость, например для разработки вакцин, оценки рисков и поддержания национальной биобезопасности. В настоящее время он активно используется в Норвежском ветеринарном институте в качестве инструмента для исследования диагнозов Y. ruckeri в норвежской аквакультуре.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Настоящее исследование финансировалось Норвежским исследовательским фондом морепродуктов FHF (проект No 901119 и 901505). Мы хотели бы поблагодарить всех участников бактериальных изолятов и образцов, используемых при разработке метода.
Materials
| 22°C/15°C incubator | As preferred. | NA | |
| 5' Labeled Primer, 10K PMOL, Desalted, Dry | Thermo Fisher Scientific | 450007 | Sequences and labelling in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer. |
| Agarose, universal, peqGOLD | VWR | 732-2789P/732-2788 | Used during gel electrophoresis. |
| Avant 3500xL Genetic Analyzer | Thermo Fisher Scientific | A30469 | Used for capillary electrophoresis fragment analysis. |
| BioNumerics7 modules | Applied Maths | NA | Used for generating Minimum spanning trees from MLVA data. |
| Centrifuge(s) | As preferred. | NA | |
| Custom DNA Oligo, 25N, Desalted, Dry | Thermo Fisher Scientific | A15612 | Sequences in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer. |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Fisher Scientific | R0611 | Loading dye used during gel electrophoresis. |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | Centrifuge tubes used during DNA extraction. |
| Freezer | As preferred. | NA | |
| Fume cupboard | As preferred. | NA | |
| Gel electrophoresis system | As preferred. | NA | |
| GelRed Nucleic Acid Stain, 10,000X in water | Biotium | 41003 | Fluorescent nucleic acid dye used during gel electrophoresis. |
| GeneMapper Software 5 | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | Used for reading electropherograms from capillary electrophoresis. |
| GeneRuler 50 bp DNA Ladder, ready-to-use | Thermo Fisher Scientific | SM0373 | DNA ladder used during gel electrophoresis. |
| GeneScan 600 LIZ dye Size Standard v2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4408399 | Size standard used during capillary electrophoresis. |
| Heating block | As preferred. | NA | |
| Hi-Di Formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320/4440753 | Deionized formamide used during capillary electrophoresis. Prepare working aliquouts. |
| Milli-Q water | NA | NA | Purified water used during PCR and capillary electrophoresis. Standard recipe; produced in-house. |
| Multiplex PCR Plus Kit | Qiagen | 206151/206152 | |
| PCR thermal cycler | As preferred. | NA | |
| POP-7 Polymer for 3500 Dx/3500xL Dx Genetic Analyzers | Thermo Fisher Scientific | A26077/4393713/4393709 | Separation matrix used during capillary electrophoresis. |
| Pure culture Yersinia ruckeri | NA | NA | E.g. cryopreserved or fresh. |
| RNase-free water | Qiagen | NA | In: Multiplex PCR Plus Kit |
| Tris-borate-EDTA (TBE) buffer | NA | NA | Standard recipe; produced in-house. |
| Trypsine soy agar/bovine blood agar | NA | NA | Standard recipe; produced in-house. |
| UV-based gel imaging/visualisation system | As preferred. | NA | |
| Vortexer | As preferred. | NA |
References
- Barnes, A. C. Enteric redmouth disease (ERM) (Yersinia ruckeri). Fish Diseases and Disorders, Vol 3: Viral, Bacterial and Fungal Infections. 3, 484-511 (2011).
- Barnes, A. C., et al. Whole genome analysis of Yersinia ruckeri isolated over 27 years in Australia and New Zealand reveals geographical endemism over multiple lineages and recent evolution under host selection. Microbial Genomics. 2 (11), 000095 (2016).
- Calvez, S., Mangion, C., Douet, D. G., Daniel, P. Pulsed-field gel electrophoresis and multi locus sequence typing for characterizing genotype variability of Yersinia ruckeri isolated from farmed fish in France. Veterinary Research. 46, 73 (2015).
- Bastardo, A., Ravelo, C., Romalde, J. L. Multilocus sequence typing reveals high genetic diversity and epidemic population structure for the fish pathogen Yersinia ruckeri. Environmental Microbiology. 14 (8), 1888-1897 (2012).
- Wheeler, R. W., et al. Yersinia ruckeri biotype 2 isolates from mainland Europe and the UK likely represent different clonal groups. Diseases of Aquatic Organisms. 84 (1), 25-33 (2009).
- Eyre, D. W., et al. Comparison of multilocus variable-number tandem-repeat analysis and whole-genome sequencing for investigation of Clostridium difficile transmission. Journal of Clinical Microbiology. 51 (12), 4141-4149 (2013).
- Sun, M., et al. Multiple Locus Variable-Number Tandem-Repeat and Single-Nucleotide Polymorphism-Based Brucella Typing Reveals Multiple Lineages in Brucella melitensis Currently Endemic in China. Frontiers in Veterinary Science. 4, (2017).
- Bouchouicha, R., et al. Comparison of the performances of MLVA vs. the main other typing techniques for Bartonella henselae. Clinical Microbiology and Infection. 15, 104-105 (2009).
- Dahyot, S., et al. Multiple-Locus Variable Number Tandem Repeat Analysis (MLVA) and Tandem Repeat Sequence Typing (TRST), helpful tools for subtyping Staphylococcus lugdunensis. Scientific Reports. 8 (1), (2018).
- Elberse, K. E. M., Nunes, S., Sá-Leão, R., van der Heide, H. G. J., Schouls, L. M. Multiple-locus variable number tandem repeat analysis for Streptococcus pneumoniae: Comparison with PFGE and MLST. PLoS ONE. 6 (5), (2011).
- Matejusova, I., et al. Multilocus variable-number tandem-repeat genotyping of Renibacterium salmoninarum, a bacterium causing bacterial kidney disease in salmonid fish. BMC microbiology. 13, 285 (2013).
- Duodu, S., et al. An improved multiple-locus variable-number of tandem repeat analysis (MLVA) for the fish pathogen Francisella noatunensis using capillary electrophoresis. BMC Veterinary Research. 9, 252 (2013).
- Abayneh, T., Colquhoun, D. J., Austin, D., Sørum, H. Multilocus variable number tandem repeat analysis of Edwardsiella piscicida isolates pathogenic to fish. Journal of Fish Diseases. 37 (11), 941-948 (2014).
- Gulla, S., et al. Multilocus variable-number tandem-repeat analysis of Yersinia ruckeri confirms the existence of host specificity, geographic endemism, and anthropogenic dissemination of virulent clones. Applied and Environmental Microbiology. 84 (16), (2018).
- Pasqualotto, A. C., Denning, D. W., Anderson, M. J. A cautionary tale: Lack of consistency in allele sizes between two laboratories for a published multilocus microsatellite typing system. Journal of Clinical Microbiology. 45 (2), 522-528 (2007).
- Lista, F., et al. Genotyping of Bacillus anthracis strains based on automated capillary 25-loci multiple locus variable-number tandem repeats analysis. BMC Microbiology. 6, 33 (2006).
- . Thermo Fisher Scientific DNA Fragment Analysis by Capillary Electrophoresis Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/fragment-analysis-chemistry-guide.pdf (2014)
