Multi-Locus variabele-nummer tandem-herhaling analyse van de vis-pathogene bacterie Yersinia ruckeri door multiplex PCR en capillaire elektroforese
Summary
De multi-Locus variabele-aantal tandem-repeat analyse (MLVA) assay hier gepresenteerd maakt goedkope, robuuste en draagbare hoge-resolutie genotypering van de vis-pathogene bacterie Yersinia ruckeri. Beginnend bij zuivere culturen, gebruikt de assay multiplex PCR en capillaire elektroforese om tien-loci MLVA-profielen voor downstreamtoepassingen te produceren.
Abstract
Yersinia ruckeri is een belangrijk pathogeen van gekweekte zalmachtigen wereldwijd, maar eenvoudige hulpmiddelen geschikt voor epizootiologische onderzoeken (infectie tracing, enz.) van deze bacterie ontbreken. Een multi-Locus variabele-nummer tandem-repeat analyse (MLVA) test werd daarom ontwikkeld als een gemakkelijk toegankelijk en eenduidig instrument voor het met hoge resolutie genotypering van teruggewonnen isolaten. Voor de hier gepresenteerde MLVA-assay wordt DNA geëxtraheerd uit gekweekte Y. ruckeri monsters door het koken van bacteriële cellen in water, gevolgd door het gebruik van supernatant als sjabloon voor PCR. Primer-paren gericht op tien variabele-nummer tandem-repeat (VNTR) loci, afgewisseld door de Y. ruckeri genoome, worden gelijkelijk verdeeld over 2 5-Plex PCR-reacties die onder identieke fiets condities lopen. Voorwaartse primers worden geëtiketteerd met een van de drie fluorescerende kleurstoffen. Na ampliconlengte voor temp bevestiging door gel elektroforese, worden PCR-producten verdund en onderworpen aan capillaire elektroforese. Van de resulterende elektroferogram profielen, pieken die elk van de VNTR loci zijn grootte-genoemd en gebruikt voor het berekenen van VNTR herhaling graven in silico. Resulterende tien-cijferige MLVA-profielen worden vervolgens gebruikt voor het genereren van minimale spanning bomen waardoor epizootiologische evaluatie door clusteranalyse. De zeer draagbare uitvoergegevens, in de vorm van numerieke MLVA-profielen, kunnen snel worden vergeleken tussen Labs en geplaatst in een spatiotemporele context. De hele procedure van gekweekte kolonie tot epizoötiologische evaluatie kan worden voltooid voor maximaal 48 j. ruckeri isolaten binnen één werkdag.
Introduction
Yersinia ruckeri, een gram-negatieve bacterie en lid van de yersiniaceae familie, veroorzaakt Yersiniose in gekweekte zalmachtigen vissen wereldwijd1. Het is gemakkelijk gediagnosticeerd van besmette vis door teelt op vele soorten agar media, maar tot voor kort was er weinig bekend over de bevolkingsstructuur en epizootiologie van Y. ruckeri over de hele wereld en in verschillende habitats (gastheer soorten, enz.). Bestaande serotype systemen voor Y. ruckeri zijn inconsistent, gebrek aan wederzijdse compatibiliteit en bieden een lage epidemiologische resolutie. Sommige moleculaire studies op de bacterie zijn uitgevoerd, met technieken zoals multilocus sequentie typen (mlst), gepulseerde veld gel elektroforese (PFGE) of whole-genoom sequentie (WGS) analyse2,3,4 ,5. MLST biedt echter geen voldoende hoge resolutie voor routine infectie tracering, terwijl PFGE arbeids veeleisend is en resultaten oplevert die niet gemakkelijk overdraagbaar zijn in laboratoria. Terwijl de WGS-analyse een nabije eindresolutie zou opleveren, zou het opzetten en uitvoeren van dergelijke analyses een voorwaarde zijn voor technische-en bioinformatica capaciteiten die nog steeds beperkt blijven tot een relatief klein aantal laboratoria.
Multi-Locus variabele-nummer tandem-repeat analyse (mlva) vertegenwoordigt een eenvoudig en gemakkelijk toegankelijk moleculair type gereedschap, dat een genetische resolutie biedt in sommige gevallen die bijna overeenkomen met die van WGS-analyse6,7. De techniek is gebaseerd op herhalings getalvariatie in geselecteerde variabele-nummer tandem-repeat (VNTR) loci, resulterend in uitvoergegevens die zeer transporteerbaar zijn, waardoor vergelijking van geprofileerde isolaten naar online databases en over Labs eenvoudig is. Hoewel mlst blijft de gouden standaard voor epidemiologische typen van veel bacteriële pathogenen, een toenemend aantal studies identificeren een significant hogere discriminerende kracht van mlva8,9,10. Er zijn ook verschillende protocollen gepubliceerd die gericht zijn op vispathogene bacteriën, zoals Francisella noatunensis, edwardsiella en Renibacterium salmoninarum11,12, 13.
Het ten-loci MLVA-protocol dat hier werd gepresenteerd, dat onlangs de basis vormde voor een uitgebreide Y. ruckeri populatie studie14, omvat extractie van DNA uit agar-gekweekte kolonies, multiplex PCR en capillaire ELEKTROFORESE (CE), gevolgd door downstream in silico-toepassingen. Voor elk onderzocht isolaat worden twee multiplex PCRs, beide met vijf fluorescently gelabelde primer paren (6FAM, NED of VIC), elk gericht op individuele VNTR-gebieden, parallel uitgevoerd onder identieke omstandigheden. Na verificatie van de PCR-amplicons door gelelektroforese (GE) worden PCR-producten vóór de CE-analyse verdund en pieken die de respectieve VNTR loci vertegenwoordigen, worden van de resulterende electropherogrambestanden de grootte genoemd. Samen met Locus-specifieke formules accounting voor kleine, sequentie-specifieke verschillen in CE migratiepatronen, VNTR CE grootte aanroepen worden vervolgens gebruikt voor het berekenen van VNTR REPEAT tellingen die worden samengevoegd in tien-cijferige MLVA-profielen. Deze worden gebruikt als input voor epizoötiologische evaluaties (bijvoorbeeld door clusteranalyse in minimum spanning tree (MST) diagrammen).
Protocol
Representative Results
Discussion
Beide multiplex PCRs gepresenteerd hier zijn relatief robuust verschenen in het gezicht van slechte template DNA-kwaliteit, maar een gebrek aan PCR-versterking werd toch af en toe waargenomen bij het gebruik van sjablonen met extreem hoge DNA-concentraties. Deze problemen werden gemakkelijk opgelost door de templates vóór PCR te verdunen. Andere methoden voor DNA-extractie dan degene die hier werkzaam zijn, kunnen ook worden gebruikt (bijv. commerciële Kits).
Hoewel vijf amplicons worden verwacht van elke multiplex-PCR-reactie, moeten vijf visueel te onderscheiden banden niet altijd van GE worden verwacht, omdat sommige (verschillend gelabelde) VNTR loci binnen dezelfde reactie overlappende grootte bereiken hebben. De uiteindelijke PCR-Verleng tijd van 60 min kan indien nodig worden verkort, maar zal waarschijnlijk resulteren in het toegenomen optreden van gespleten pieken in daaropvolgende CE-elektroforgrammen (zie hieronder). Met name omdat het doel van de GE-stap puur voor kwalitatieve verificatie van PCR-amplicons is, kan de uitvoeringstijd, het voltage en/of het gelrecept als voorkeur worden aangepast. Indien GE in het bijzonder zwakke banden opmerkt, kan het raadzaam zijn de verdunningsfactor van die monsters vóór de CE te verlagen.
Hoewel het hier beschreven CE-protocol werd uitgevoerd op een specifiek commercieel capillair elektroforeseapparaat (Zie tabel van de materialen), kunnen verschillende CE-systemen verschillende monster vereisten hebben, wat op zijn beurt een aantal wijzigingen aan het protocol kan . Raadpleeg de handleiding van de betreffende CE-systeemfabrikant voor instructies over geschikte reagentia/apparatuur, kalibratie etc. voor fragment analyse. Er is ook een mogelijkheid dat de vooringenomen ampliconlengte voor temp mobiliteitspatronen die tijdens de CE-markering zijn waargenomen, relatief kunnen verschillen tussen de CE-systemen en/of machines, zoals eerder is gedocumenteerd voor andere mlva-protocollen15,16. Als de uiteindelijke (afgeronde) VNTR-herhalings aantallen zich voordoen in een mate waarin dit wordt beïnvloed, betekent dit dat de Locus-specifieke variabelen s en i (tabel 1), die worden gebruikt om het aantal herhalingen van VNTR te bepalen, opnieuw moeten worden gekalibreerd. Dit betreft een lineaire regressie op percelen met een vergelijking van nauwkeurige sequentie groottes versus CE-grootte aanroepen, zoals beschreven door Gulla et al. 201814.
Split pieken en stotter pieken, beide bekende artefacten in CE gebaseerd MLVA typing17, kan worden waargenomen in electropherogrammen tijdens het aanroepen van de grootte (Figuur 4). Hoewel haperingen pieken moeten worden genegeerd, moet de langere piek consistent worden geselecteerd voor downstreamtoepassingen in het geval van gesplitste pieken gescheiden door een enkel basis paar. Bovendien zijn afwezige pieken die duiden op een gebrek aan specifieke VNTR loci zeldzaam, maar kunnen zich voordoen, in welk geval een herhalings telling van ‘ 0 ‘ moet worden toegewezen. Als de start cultuur waaruit DNA wordt geëxtraheerd niet zuiver is (d.w.z. meer dan één Y. ruckeri -subtype bevat), kunnen meerdere hoge pieken die overeenkomen met verschillende allelen van dezelfde Locus/loci worden waargenomen na de CE. Secundaire cultivaties moeten dan worden uitgevoerd van enkele kolonies voorafgaand aan nieuwe DNA-extractie voor opnieuw typen.
Zoals vermeld in het Protocol, moet template DNA voor PCR standaard worden geëxtraheerd uit zuivere culturen van Y. ruckeri. In enkele gevallen, echter, eieren-vloeistofmonsters testen positief voor Y. ruckeri door qPCR (CT-waarden < 27) werden met succes mlva direct getypt, zonder voorafgaande kweek, met behulp van een verhoogde hoeveelheid GENOMISCH DNA (geëxtraheerd met commerciële Kit) als sjabloon. Hoewel deze aanpak niet uitgebreid is getest en niet is geverifieerd, geeft dit wel het potentieel van deze MLVA-test aan voor onderzoek van complexe biologische matrices die DNA uit een reeks verschillende organismen bevatten, naast Y. ruckeri.
De gehele MLVA-type procedure die hier wordt gepresenteerd, van DNA-extractie tot epizootiologische evaluatie, kan in één werkdag worden voltooid. Het aantal onderzochte monsters is echter in een sublineaire relatie met de tijd die nodig is voor DNA-extractie, PCR en CE, en de methode is daarom veel meer tijd efficiënt bij het gelijktijdig uitvoeren van meerdere monsters. Dit is niettemin het geval voor de meeste Lab-gebaseerde methoden, en als een instrument voor epidemiologische ondertypen van Y. ruckeri, de combinatie van hoge resolutie, eenvoud en draagbaarheid maakt deze mlva assay superieur aan eerder gepubliceerde protocollen4 ,5. Het is ook gebruikt om te controleren of de beperkte epidemiologische relevantie van Y. ruckeri sero typing14.
Door middel van een uitgebreid MLVA-gebaseerd bevolkingsonderzoek met 484 Y. ruckeri isolaten teruggewonnen uit een reeks spatiotemporele oorsprong en habitats (gastheer vis, milieu, enz.), ons begrip met betrekking tot de epizoötiologie en de populatie structuur van dit belangrijke vispathogeen werd aanzienlijk verhoogd14. MLVA typing kon de tracering van klonen gedissemineerde in tientallen jaren, vermoedelijk door het vervoer van vis, evenals de identificatie van lokaal gesloten stammen. Bovendien, terwijl sommige klonale complexen van de bacterie duidelijk zou kunnen worden geassocieerd met ziekte in het bijzonder vissen gastheren (regenboogforel en Atlantische zalm, respectievelijk), anderen werden alleen teruggewonnen uit milieubronnen en/of klinisch onaangetast vis Specimens. De toepasselijkheid van de methode is dus niet alleen beperkt tot het opsporen van infecties, omdat zij ook informatie kan verschaffen over mogelijke relevantie, bijvoorbeeld voor de ontwikkeling van vaccins, de risicobeoordeling en het onderhoud van de nationale bioveiligheid. Het is momenteel actief in gebruik bij het Noorse veterinaire Instituut als een instrument voor het onderzoeken van Y. ruckeri diagnoses in de Noorse aquacultuur.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De huidige studie werd gefinancierd door het Noorse Seafood Research Fund, FHF (project nrs. 901119 en 901505). We willen alle bijdragers van bacteriële isolaten en monsters die worden gebruikt tijdens de ontwikkeling van de methode bedanken.
Materials
| 22°C/15°C incubator | As preferred. | NA | |
| 5' Labeled Primer, 10K PMOL, Desalted, Dry | Thermo Fisher Scientific | 450007 | Sequences and labelling in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer. |
| Agarose, universal, peqGOLD | VWR | 732-2789P/732-2788 | Used during gel electrophoresis. |
| Avant 3500xL Genetic Analyzer | Thermo Fisher Scientific | A30469 | Used for capillary electrophoresis fragment analysis. |
| BioNumerics7 modules | Applied Maths | NA | Used for generating Minimum spanning trees from MLVA data. |
| Centrifuge(s) | As preferred. | NA | |
| Custom DNA Oligo, 25N, Desalted, Dry | Thermo Fisher Scientific | A15612 | Sequences in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer. |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Fisher Scientific | R0611 | Loading dye used during gel electrophoresis. |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | Centrifuge tubes used during DNA extraction. |
| Freezer | As preferred. | NA | |
| Fume cupboard | As preferred. | NA | |
| Gel electrophoresis system | As preferred. | NA | |
| GelRed Nucleic Acid Stain, 10,000X in water | Biotium | 41003 | Fluorescent nucleic acid dye used during gel electrophoresis. |
| GeneMapper Software 5 | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | Used for reading electropherograms from capillary electrophoresis. |
| GeneRuler 50 bp DNA Ladder, ready-to-use | Thermo Fisher Scientific | SM0373 | DNA ladder used during gel electrophoresis. |
| GeneScan 600 LIZ dye Size Standard v2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4408399 | Size standard used during capillary electrophoresis. |
| Heating block | As preferred. | NA | |
| Hi-Di Formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320/4440753 | Deionized formamide used during capillary electrophoresis. Prepare working aliquouts. |
| Milli-Q water | NA | NA | Purified water used during PCR and capillary electrophoresis. Standard recipe; produced in-house. |
| Multiplex PCR Plus Kit | Qiagen | 206151/206152 | |
| PCR thermal cycler | As preferred. | NA | |
| POP-7 Polymer for 3500 Dx/3500xL Dx Genetic Analyzers | Thermo Fisher Scientific | A26077/4393713/4393709 | Separation matrix used during capillary electrophoresis. |
| Pure culture Yersinia ruckeri | NA | NA | E.g. cryopreserved or fresh. |
| RNase-free water | Qiagen | NA | In: Multiplex PCR Plus Kit |
| Tris-borate-EDTA (TBE) buffer | NA | NA | Standard recipe; produced in-house. |
| Trypsine soy agar/bovine blood agar | NA | NA | Standard recipe; produced in-house. |
| UV-based gel imaging/visualisation system | As preferred. | NA | |
| Vortexer | As preferred. | NA |
References
- Barnes, A. C. Enteric redmouth disease (ERM) (Yersinia ruckeri). Fish Diseases and Disorders, Vol 3: Viral, Bacterial and Fungal Infections. 3, 484-511 (2011).
- Barnes, A. C., et al. Whole genome analysis of Yersinia ruckeri isolated over 27 years in Australia and New Zealand reveals geographical endemism over multiple lineages and recent evolution under host selection. Microbial Genomics. 2 (11), 000095 (2016).
- Calvez, S., Mangion, C., Douet, D. G., Daniel, P. Pulsed-field gel electrophoresis and multi locus sequence typing for characterizing genotype variability of Yersinia ruckeri isolated from farmed fish in France. Veterinary Research. 46, 73 (2015).
- Bastardo, A., Ravelo, C., Romalde, J. L. Multilocus sequence typing reveals high genetic diversity and epidemic population structure for the fish pathogen Yersinia ruckeri. Environmental Microbiology. 14 (8), 1888-1897 (2012).
- Wheeler, R. W., et al. Yersinia ruckeri biotype 2 isolates from mainland Europe and the UK likely represent different clonal groups. Diseases of Aquatic Organisms. 84 (1), 25-33 (2009).
- Eyre, D. W., et al. Comparison of multilocus variable-number tandem-repeat analysis and whole-genome sequencing for investigation of Clostridium difficile transmission. Journal of Clinical Microbiology. 51 (12), 4141-4149 (2013).
- Sun, M., et al. Multiple Locus Variable-Number Tandem-Repeat and Single-Nucleotide Polymorphism-Based Brucella Typing Reveals Multiple Lineages in Brucella melitensis Currently Endemic in China. Frontiers in Veterinary Science. 4, (2017).
- Bouchouicha, R., et al. Comparison of the performances of MLVA vs. the main other typing techniques for Bartonella henselae. Clinical Microbiology and Infection. 15, 104-105 (2009).
- Dahyot, S., et al. Multiple-Locus Variable Number Tandem Repeat Analysis (MLVA) and Tandem Repeat Sequence Typing (TRST), helpful tools for subtyping Staphylococcus lugdunensis. Scientific Reports. 8 (1), (2018).
- Elberse, K. E. M., Nunes, S., Sá-Leão, R., van der Heide, H. G. J., Schouls, L. M. Multiple-locus variable number tandem repeat analysis for Streptococcus pneumoniae: Comparison with PFGE and MLST. PLoS ONE. 6 (5), (2011).
- Matejusova, I., et al. Multilocus variable-number tandem-repeat genotyping of Renibacterium salmoninarum, a bacterium causing bacterial kidney disease in salmonid fish. BMC microbiology. 13, 285 (2013).
- Duodu, S., et al. An improved multiple-locus variable-number of tandem repeat analysis (MLVA) for the fish pathogen Francisella noatunensis using capillary electrophoresis. BMC Veterinary Research. 9, 252 (2013).
- Abayneh, T., Colquhoun, D. J., Austin, D., Sørum, H. Multilocus variable number tandem repeat analysis of Edwardsiella piscicida isolates pathogenic to fish. Journal of Fish Diseases. 37 (11), 941-948 (2014).
- Gulla, S., et al. Multilocus variable-number tandem-repeat analysis of Yersinia ruckeri confirms the existence of host specificity, geographic endemism, and anthropogenic dissemination of virulent clones. Applied and Environmental Microbiology. 84 (16), (2018).
- Pasqualotto, A. C., Denning, D. W., Anderson, M. J. A cautionary tale: Lack of consistency in allele sizes between two laboratories for a published multilocus microsatellite typing system. Journal of Clinical Microbiology. 45 (2), 522-528 (2007).
- Lista, F., et al. Genotyping of Bacillus anthracis strains based on automated capillary 25-loci multiple locus variable-number tandem repeats analysis. BMC Microbiology. 6, 33 (2006).
- . Thermo Fisher Scientific DNA Fragment Analysis by Capillary Electrophoresis Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/fragment-analysis-chemistry-guide.pdf (2014)
