多重PCRと毛細血管電気泳動による魚病原性細菌エルシニアラッケリの多軌変動数のカンデム繰り返し分析

注意:プロトコル全体について、ラボコート、使い捨て手袋、滅菌試薬および機器を使用して、すべてのウェットラボ手順を無菌で行うことをお勧めします。また、PCR製品(ポストPCR)のPCR増幅および/または取り扱いに使用されない別の部屋(PCR前)でPCR反応を調製することをお勧めします。製造元の推奨どおりにすべての試薬を保管してください。使用する試薬、機器、ソフトウェアの詳細については、材料の表を参照してください。 1. 細菌培養とゲノムDNAの抽出 任意の適切な寒天タイプにY.ラッケリ純粋な培養物を種まき(著者は5%ウシの血寒天を使用)、1〜2日間、または3〜4日間15°Cでインキュベートします。 各寒天プレートから、接種ループを持つ単一の代表的なコロニーを選択し、50 μLの超精製水を含む1.5 mL遠心管に移します。100°Cの加熱ブロックで7分間中断、渦、インキュベートします。 3分間16 000 x gの遠心分離機を使用し、ピペットを使用して上清を空の1.5 mL遠心管に慎重に移します。テンプレートDNAとして上清を用いて次の工程に進むか、そのような時まで-20°Cで保存する。 2. 多重PCRセットアップとサイクリング条件 注:各多重PCR反応(Y.ラッケリ単離物につき2個)は、2x多重PCRプラスマスターミックスの12.5 μL、各適切なプライマーペアの0.1〜0.2 μM(表1)およびテンプレートDNAの3μLを含むべきであり、25 μLの最終反応体積に調整する。RNaseフリー水の添加。蛍光ラベルのフォワードプライマーの光暴露を最小限に抑えることを目指します(例えば、貯蔵チューブをアルミホイルで包むことによって)。 2つの多重PCRアッセイ(表1)のそれぞれについて、サンプル数にプラス1つの陽性および1つの負の対照に従って、上記のように(テンプレートDNAを含まない)マスターミックスを調出す。さらに、10%の余剰ボリュームを許可します。調製されたマスターは、低速で穏やかに混合する渦。 各マスターミックスの22 μLを、サンプル数に応じてPCRストリップまたはプレート上の個々のウェルに別々に分配し、各ウェルに3μLのテンプレートを追加します(正対照および陰性コントロールの場合は、それぞれ検証済みのY.ラッケリのDNAを使用します)ひずみと超精製水)。シールと遠心分離機を簡単に。 次のプログラムでPCRサーマルサイクラー上のすべてのサンプルを実行します:(i)95°C(ii)で0.5分、60°Cで1.5分、72°Cで1分、(iii)68°Cで60分、次に4°Cに冷却します。プログラムは3時間未満で完了します。 3. ゲル電気泳動によるPCRアンプリコン確認 メーカーの勧告に従って、テストされるPCR反応の数に適した1xトリスボレートEDTA(TBE)バッファーに1.5%(w/v)のアガロースゲルの体積を調製する。鋳造する前に、ゲル溶液の50μLあたりの蛍光核酸色素の5μLを加え、混合する。鋳造に適したトレイと櫛を使用し、適切な数の井戸をDNAリファレンスラダーに自由に残します。 設定後、GEシステムの1x TBEバッファにゲルを沈めます。PCR製品の5 μLを2μLの荷重色素と一緒に混合し、ゲルウェルに移します。参考のために空の井戸に5 μLのDNAはしごを追加します。 約 15 cm あたり 110 V でゲルを約 1 時間実行し、UV ベースのゲルイメージング/視覚化システムを使用して、PCR アンプリコンを表す複数の (最大 5 つ) バンドの存在を確認します (図 1の例を参照)。ゲルを捨てます。次の工程に進むか、残りのPCR製品を4°Cで保存し、さらに処理します。 4. 毛細血管電気泳動セットアップと実行条件 PCRアンプリコンの確認後、精製水中のPCR製品1:10(v/v)を希釈する。シール、ミックス、遠心分離機を簡単に。 ヒューム食器棚で作業し、PCR製品あたり9 μLのホルムアミドと0.5 μLのサイズ標準からなるマスターミックスのボリュームを準備します(10%の余剰容積を可能にします)。渦は、希釈されたPCR製品の0.5 μLを追加する前に、利用可能なCEシステムに適したプレート上のウェルに9.5 μLを簡単に分配します。シール、ミックス、遠心分離機を簡単に。注意:取り扱いは注意して。ホルムアミドと水を混合すると、有毒であるギ酸が生成されます。 PCRサーマルサイクラーを使用して、4°Cに無期限に冷却する前に3分間95°Cでサンプルを変性させます。遠心分離機を簡単に取り付け、製造元の指示に従って校正されたCEシステムにプレートをロードします。 選択した装置および次の設定のために適当に試薬を使用してフラグメント分析CEを実行する:60 °C;1.6 kV(cmあたり32 V)で5 s注射。15 kV(cmあたり300V)で32分の走行時間。24毛細血管(50 cm)上の24ウェルのCE断片分析は、通常、約50分かかります。 5. VNTRサイズの呼び出し、繰り返しカウント計算とMLVAプロファイリング 注:ステップ 5.1 では、材料の表に記載されている特定のソフトウェアを使用して、エレクトロフェログラム ファイルから呼び出すY. ラッケリVNTR CE サイズについて説明します。その他の詳細とトラブルシューティングについては、ソフトウェアマニュアルを参照してください。その他のソフトウェアを使用する場合は、適切なマニュアルを参照してください。 CE 結果ファイルをインポートします(Y. ラッケリ分離ごとに 2 つ)。分析方法をマイクロサテライトデフォルトに設定し、[分析]ボタンを押す前に、サイズ標準で適切な製品選択を選択します。サイズ一致エディターを使用してサイズ標準フラグメントを正しく識別し、目に見える誤った割り当てを修正します。 読み取るサンプルを選択した後、[プロットの表示]ボタンを押し、Ctrlキーを押しながら Aキーを押して、サイズ変更テーブルの表示を有効にします。トップパネルで、VNTRアンプリコンを表す5つのピークをクリックしながらCtrlを押したままにします(必要に応じてズームツールを使用します)。注:多重PCR産物のそれぞれについて、エレクトロフェログラムは、採用された3つの染料の間に分布する5つのピークを示します(表1のフォワードプライマーの5’色素標識と図2の2つの例を参照)。 Ctrl キーを押しながら G キーを押して、5 つのハイライト表示されたピークの特性のみを表示するサイジング テーブルをフィルタリングし、ダウンストリーム アプリケーションの各 VNTR 軌跡 (表1を参照)の CE サイズコールを記録します。 CE中の偏ったアンプリコン移動パターンを考慮するために、以下に示す式に従って正確なVNTR繰り返しカウントを計算し、軌跡特異的変数と共にVNTR CEサイズ呼び出しを採用する(表1参照)。効率を上めるには、このプロセスを自動化することをお勧めします (例えば、スプレッドシートテンプレートを使用して)。 ラウンド計算された VNTR 繰り返しは、最も近い整数にカウントされ、10 桁の文字列に連結され、それぞれが単一の Y.ラッケリ分離の MLVA プロファイルを表します。 6. MLVAデータの最小スパニングツリークラスタ分析 注:ステップ 6 では、材料の表に記載されている特定のソフトウェアを使用して、Y.ラッケリMLVA データから MST ダイアグラムを作成する方法について説明します。その他の詳細とトラブルシューティングについては、ソフトウェアマニュアルを参照してください。その他のソフトウェアを使用する場合は、適切なマニュアルを参照してください。 新しいデータベースを作成し、MLVA プラグインをアクティブにすることを選択します。 Y. ラッケリMLVA プロファイルとメタデータをインポートする文字タイプのデータを選択し、その後にインポート フィールドと文字が続きます (ストレージ形式に応じてさらにサブ選択します)。プロンプトが表示された場合は、インポート ファイルの内容に従ってインポート ルールを指定します:宛先タイプ列で、VNTR 繰り返しを文字値として分類します: VNTR、およびその他のメタデータをエントリ情報: エントリ情報フィールド.注:比較およびコンテキストについては、現在の MLVA プロトコル14を採用した元のペーパーと共に、パブリッシュされたデータセット全体 (オープン アクセス) をインポートすることもできます。Y.ラッケリ分離物(n = 484)の多様なコレクションに関するMLVAプロファイルとメタデータは、その研究で精査され、その補足材料(表S1およびS2)から次のリンクを通じて入手可能https://aem.asm.org/content/84/16/e00730-18/figures-only#fig-data-additional-files 実験タイプパネルで、VNTRエントリを開き、各VNTR軌跡の最小値と最大値をそれぞれ0と100に設定します。[全般設定]で、小数点以下の桁数を0に設定し、[データ型]で[数値]を選択します。不在値をゼロと見なすように確認します。 MST クラスター分析用にインポートされたサンプルを選択し、[新しい比較の作成] ボタン (比較パネル) をクリックします。 MST の視覚的な表示が必要な場合は、[グループ] パネルで使用できるさまざまなオプションを使用して、サンプルを色付きのグループ (特定のメタデータ特性に従ってなど) に割り当てます。注:グループは、次の手順の後に遡及的に作成または変更することもできます。 選択したサンプルに基づいて MST ダイアグラムを生成するには、カテゴリ データの [高度なクラスター分析]と[MST]を選択します。 さらに、MST の視覚的な表示を優先として変更します (例えば、パーティションパラメータ、ノード/ブランチ ラベリング、架面、凡例などを追加するなど)。図 3の例を参照してください。注:クラスター(クローン複合体)のパーティション分割しきい値 ≤4/10 非同一VNTR lociは、>5/10 非同一VNTR lociを表す分岐接続の隠蔽に加えて、以前に生成されたMLVAデータに基づくMSTクラスター分析に採用されていた。このプロトコル14 を使用します。前述の 484 Y. ラッケリMLVA プロファイルのデータセットがインポートされた場合、これらのサンプルは MST クラスター分析 (前述のように) に含めて、グローバルおよび履歴コンテキストを提供することもできます。これは、例えば、前述のクローン複合体と関連するサンプル、ならびにまだ説明されていない系統を表すサンプルの同定を容易にする。使用可能なメタデータに応じて、結果として得られる MST ダイアグラムは、特定の特性 (地理、ホスト、時間など) にリンクされた最終的なクラスタリング パターンを検出するなど、さまざまな方法で精査できます。 必要に応じて、[画像のエクスポート] 選択を使用して、ファイナライズされた MST を必要な形式でエクスポートします。