O ensaio de análise em tandem-repetição de número variável multi-Locus (MLVA) apresentado aqui permite a genotipagem de alta resolução barata, robusta e portátil da bactéria patogênica Yersinia ruckeri. Partindo das culturas puras, o ensaio emprega o PCR multiplex e a electroforese capilar para produzir os perfis do MLVA do dez-loci para aplicações a jusante.
Yersinia ruckeri é um importante patógeno de salmonídeos cultivados em todo o mundo, mas ferramentas simples adequadas para investigações epizootiológicas (rastreamento de infecção, etc.) desta bactéria têm sido falta. Um ensaio de análise de repetição em tandem de número variável (MLVA) de múltiplos lócus foi, portanto, desenvolvido como uma ferramenta de fácil acesso e inequívoca para genotipagem de alta resolução de isolados recuperados. Para o ensaio MLVA aqui apresentado, o DNA é extraído de amostras cultivadas de Y. ruckeri por células bacterianas fervente em água, seguida pelo uso de sobrenadante como modelo para PCR. Os pares da primeira demão que alvejam dez loci do tandem-repeat do número variável (VNTR), intercalados durante todo o genoma de Y. ruckeri , são distribuídos ingualmente entre as reações do PCR do 2 5-Plex que funcionam circunstâncias de ciclagem idênticas. Os primers para frente são rotulados com qualquer uma das três corantes fluorescentes. Após a confirmação do amplicon pela electroforese do gel, os produtos do PCR são diluídos e sujeitados à electroforese capilar. Dos perfis resultantes do electroferograma, os picos que representam cada um dos locus de VNTR são tamanho-chamados e empregado para calcular contagens da repetição de VNTR no silico. Os perfis de MLVA de dez dígitos resultantes são usados para gerar árvores de abrangência mínima permitindo avaliação epizootiológica por análise de cluster. Os dados de saída altamente portáteis, na forma de perfis numéricos de MLVA, podem ser comparados rapidamente entre laboratórios e colocados em um contexto espaciotemporal. O procedimento inteiro da colônia cultivada à avaliação epizootiológica pode ser terminado para até 48 Y. os isolados de ruckeri dentro de um único dia de trabalho.
Yersinia ruckeri, uma bactéria Gram-negativa e membro da família yersiniaceae, causa Yersiniose em peixes de salmonídeo cultivados no mundo inteiro1. É prontamente diagnosticada a partir de peixes infectados por cultivo em muitos tipos de meios de agar, mas até recentemente, pouco se sabe sobre a estrutura populacional e epizootiologia de Y. ruckeri em todo o mundo e em diferentes habitats (espécies hospedeiras, etc.). Os sistemas de sorodigitação existentes para Y. ruckeri são inconsistentes, não têm compatibilidade mútua e oferecem baixa resolução epidemiológica. Alguns estudos moleculares sobre a bactéria têm sido conduzidos, empregando técnicas como a tipagem de sequências multilocus (MLST), a eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE) ou a análise da sequência do genoma inteiro (WGS)2,3,4 ,5. No entanto, MLST não fornece uma resolução suficientemente alta para rastreamento de infecção de rotina, enquanto PFGE é exigente trabalho e produz resultados que não são prontamente portáteis através de laboratórios. Embora a análise da WGS forneça uma resolução definitiva, o estabelecimento e a implementação de tais análises seriam pré-requisitos de recursos técnicos e de Bioinformática que ainda permanecem restritos a um número relativamente pequeno de laboratórios.
A análise do tandem-repeat do número variável do multi-Locus (MLVA) representa uma ferramenta de digitação molecular simples e fàcilmente acessível, que ofereça uma definição genética em alguns casos que combinam quase aquela da análise de WGS6,7. A técnica é baseada na variação numérica repetida em loci de repetição em tandem (VNTR) de número variável selecionado, resultando em dados de saída que são altamente transportáveis, fazendo a comparação de isolados perfilados em bancos de dados on-line e em laboratórios diretos. Embora o MLST permaneça como padrão-ouro para a digitação epidemiológica de muitos patógenos bacterianos, um número crescente de estudos identifica um poder discriminatório significativamente maior de MLVA8,9,10. Vários protocolos também foram publicados visando bactérias patogênicas de peixes, como Francisella noatunensis, Edwardsiella Piscicida e Renibacterium salmoninarum11,12, trezeanos.
O protocolo MLVA de dez Locos apresentado aqui, que recentemente formou a base para um extenso estudo populacional de Y. ruckeri 14, envolve a extração de DNA de colônias cultivadas em ágar, PCR multiplex e eletroforese capilar (CE), seguido de jusante em aplicações de silico. Para cada isolado examinado, dois PCRs multiplex, ambos contendo cinco pares de primers fluorescentamente rotulados (6FAM, NED ou VIC), cada um visando regiões individuais de VNTR, são executados em paralelo em condições idênticas. Depois da verificação de amplicões do PCR pela electroforese do gel (GE), os produtos do PCR são diluídos antes da análise do CE, e os picos que representam os Locus respectivos de VNTR são tamanho-chamados dos arquivos resultantes do electroferograma. Junto com as fórmulas Locus-specific que esclarecendo discrepâncias menores, específicas da seqüência em testes padrões migratórios do CE, as chamadas do tamanho do CE de VNTR são empregadas então calculando contagens da repetição de VNTR que são concatenadas em perfis do MLVA do dez-dígito. Estes são usados como a entrada para avaliações epizootiológica (por exemplo, pela análise do conjunto em diagramas de Spanning Tree mínimo (MST)).
Ambos os PCRs multiplex apresentados aqui apareceram relativamente robustos na cara da qualidade pobre do ADN do molde, mas a falta da amplificação do PCR foi observada não obstante ocasionalmente ao usar moldes com concentrações extremamente elevadas do ADN. Estes problemas foram resolvidos prontamente diluindo os moldes antes do PCR. Outros métodos para a extração do ADN do que esse empregado aqui podem igualmente ser usados (por exemplo, jogos comerciais).
Embora cinco amplicões sejam esperados de cada reação multiplex do PCR, cinco bandas visualmente distinguíveis não devem sempre ser esperadas de GE, porque algum (etiquetado diferentemente) loci de VNTR dentro da mesma reação tem escalas de tamanho de sobreposição. O tempo final da extensão do PCR de 60 de minuto pode ser encurtado se requerido, mas conduzirá provavelmente à ocorrência aumentada de picos rachados em eletroferogramas subseqüentes do CE (veja abaixo). Notavelmente, como a finalidade da etapa do GE é puramente para a verificação qualitativa de amplicons do PCR, o tempo de execução, a tensão e/ou a receita do gel podem ser ajustados como preferiu. Se as bandas particularmente fracas forem observadas pela GE, pode ser aconselhável reduzir o fator de diluição dessas amostras antes da CE.
Quando o protocolo do CE descrito aqui foi funcionado em um instrumento capilar comercial específico da electroforese (veja a tabela dos materiais), os sistemas diferentes do CE podem ter exigências diferentes da amostra, que podem por sua vez alertar algumas modificações ao protocolo . Consulte o manual do respectivo fabricante do sistema CE para obter instruções sobre os reagentes/equipamentos apropriados, calibração etc. para análise de fragmentos. Há também a possibilidade de que os padrões de mobilidade tendenciosos amplicon observados durante a CE podem diferir, relativamente, através de sistemas CE e/ou máquinas, como tem sido previamente documentado para outros protocolos MLVA15,16. Se ocorrer em uma medida em que as contagens de repetição VNTR finais (arredondadas) sejam afetadas, isso significa que as variáveis Locus-específicas s e i (tabela 1), usadas para determinar contagens de repetição de VNTR, devem ser recalibradas. Isso envolve a regressão linear em parcelas comparando tamanhos de sequência precisos versus chamadas de tamanho CE, conforme descrito por Gulla et al. 201814.
Picos divididos e picos de gaguejar, ambos os artefatos bem conhecidos na MLVA baseada em CE digitando17, podem ser observados em eletroferogramas durante a chamada de tamanho (Figura 4). Embora os picos de gaguejar devam ser desconsiderados, o pico mais longo deve ser consistentemente selecionado para aplicações downstream no caso de picos divididos separados por um único par base. Além disso, os picos ausentes que indicam a falta de Locus específicos de VNTR são raros, mas podem ocorrer, caso em que uma contagem da repetição de ‘ 0 ‘ deve ser atribuída. Se a cultura inicial a partir da qual o DNA é extraído não é pura (ou seja, contém mais de um subtipo Y. ruckeri ), vários picos altos correspondentes a diferentes alelos do mesmo locus/loci podem ser observados após a CE. Os cultivos secundários devem então ser executados das únicas colônias antes da extração nova do ADN para re-typing.
Como indicado no protocolo, o ADN do molde para o PCR deve por padrão ser extraído das culturas puras de Y. ruckeri. Em alguns casos, entretanto, as amostras do ovo-líquido que testam o positivo para Y. ruckeri por qPCR (CT-valores < 27) eram com sucesso MLVA datilografado diretamente, sem cultivo prévio, usando uma quantidade aumentada de ADN genomic (extraído com o jogo comercial) como o molde. Embora esta aproximação não seja testada extensivamente nem verificada, indica o potencial deste ensaio de MLVA para a examinação de matrizes biológicas complexas que contêm o ADN de uma escala de organismos diferentes além do que Y. ruckeri.
Todo o procedimento de digitação do MLVA aqui apresentado, desde a extração do DNA até a avaliação epizootiológica, pode ser completado em um único dia de trabalho. Entretanto, o número de amostras examinadas está em uma relação sublinear com o tempo exigido para a extração do ADN, o PCR e o CE, e o método é conseqüentemente muito mais tempo eficiente ao executar amostras múltiplas simultaneamente. Este é, no entanto, o caso para a maioria dos métodos baseados em laboratório, e como uma ferramenta para a subdigitação epidemiológica de Y. ruckeri, a combinação de alta resolução, simplicidade e portabilidade torna este ensaio MLVA superior aos protocolos publicados anteriormente4 ,5. Também tem sido utilizada para verificar a relevância epidemiológica limitada de Y. ruckeri sorotipagem14.
Através de um abrangente estudo populacional baseado em MLVA envolvendo 484 Y. ruckeri isolados recuperados de uma variedade de origens e habitats espaciotemporais (peixes hospedeiros, meio ambiente, etc.), nosso entendimento sobre a epizootiologia e população a estrutura deste patógeno importante dos peixes foi aumentada substancialmente14. A digitação de MLVA permitiu o rastreamento de clones disseminados antropogenicamente ao longo de décadas, presumivelmente através do transporte de peixes, bem como identificação de cepas confinadas localmente. Além disso, enquanto alguns complexos clonais da bactéria poderiam ser claramente associados com a doença em particular hospedeiros de peixes (truta arco-íris e salmão do Atlântico, respectivamente), outros foram recuperados apenas de fontes ambientais e/ou peixes clinicamente não afetados Espécimes. A aplicabilidade do método é, portanto, não apenas limitada ao rastreamento de infecção, pois também pode fornecer informações de relevância potencial, por exemplo, para o desenvolvimento de vacinas, avaliação de riscos e manutenção da Biossegurança nacional. Atualmente, está em uso ativo no Instituto veterinário norueguês como uma ferramenta para investigar os diagnósticos de Y. ruckeri na aquicultura norueguesa.
The authors have nothing to disclose.
O presente estudo foi financiado pelo fundo norueguês de pesquisa de frutos do mar, FHF (projeto n º 901119 e 901505). Agradecemos a todos os contribuintes de isolados bacterianos e amostras utilizadas durante o desenvolvimento do método.
22°C/15°C incubator | As preferred. | NA | |
5' Labeled Primer, 10K PMOL, Desalted, Dry | Thermo Fisher Scientific | 450007 | Sequences and labelling in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer. |
Agarose, universal, peqGOLD | VWR | 732-2789P/732-2788 | Used during gel electrophoresis. |
Avant 3500xL Genetic Analyzer | Thermo Fisher Scientific | A30469 | Used for capillary electrophoresis fragment analysis. |
BioNumerics7 modules | Applied Maths | NA | Used for generating Minimum spanning trees from MLVA data. |
Centrifuge(s) | As preferred. | NA | |
Custom DNA Oligo, 25N, Desalted, Dry | Thermo Fisher Scientific | A15612 | Sequences in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer. |
DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Fisher Scientific | R0611 | Loading dye used during gel electrophoresis. |
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | Centrifuge tubes used during DNA extraction. |
Freezer | As preferred. | NA | |
Fume cupboard | As preferred. | NA | |
Gel electrophoresis system | As preferred. | NA | |
GelRed Nucleic Acid Stain, 10,000X in water | Biotium | 41003 | Fluorescent nucleic acid dye used during gel electrophoresis. |
GeneMapper Software 5 | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | Used for reading electropherograms from capillary electrophoresis. |
GeneRuler 50 bp DNA Ladder, ready-to-use | Thermo Fisher Scientific | SM0373 | DNA ladder used during gel electrophoresis. |
GeneScan 600 LIZ dye Size Standard v2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4408399 | Size standard used during capillary electrophoresis. |
Heating block | As preferred. | NA | |
Hi-Di Formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320/4440753 | Deionized formamide used during capillary electrophoresis. Prepare working aliquouts. |
Milli-Q water | NA | NA | Purified water used during PCR and capillary electrophoresis. Standard recipe; produced in-house. |
Multiplex PCR Plus Kit | Qiagen | 206151/206152 | |
PCR thermal cycler | As preferred. | NA | |
POP-7 Polymer for 3500 Dx/3500xL Dx Genetic Analyzers | Thermo Fisher Scientific | A26077/4393713/4393709 | Separation matrix used during capillary electrophoresis. |
Pure culture Yersinia ruckeri | NA | NA | E.g. cryopreserved or fresh. |
RNase-free water | Qiagen | NA | In: Multiplex PCR Plus Kit |
Tris-borate-EDTA (TBE) buffer | NA | NA | Standard recipe; produced in-house. |
Trypsine soy agar/bovine blood agar | NA | NA | Standard recipe; produced in-house. |
UV-based gel imaging/visualisation system | As preferred. | NA | |
Vortexer | As preferred. | NA |