משתנה רב-לוקוס-ניתוח חוזר של מספר מחזור של הדג -חיידק הפתוגניים באמצעות מולטיפלקס ואלקטרופורזה קפיסימית

התראה: בשלמותו של הפרוטוקול, מומלץ לבצע את כל הליכי מעבדה רטובים באמצעות מעילי מעבדה, כפפות חד פעמיות, ריאגנטים סטרילי וציוד. כמו כן, מומלץ להכין תגובות PCR בחדר נפרד (טרום PCR) לא משמש להגברה ו/או טיפול במוצרי PCR (פוסט-PCR). אחסן את כל הריאגנטים כפי שמומלץ על ידי היצרן. ראה טבלת חומרים לפרטים נוספים על ריאגנטים, ציוד ותוכנה בשימוש. 1. בקטריאלי לטיפוח והפקת דנ א גנומית לזרוע את החוצה בתרבויות טהורות על כל סוג אגר מתאים (המחברים השתמשו 5% בושם בדם אגר) ו דגירה ב 22 ° c עבור 1-2 ימים, או 15 ° צ’ עבור 3-4 ימים. מכל צלחת אגר, לבחור מושבה ייצוגית אחת עם לולאה החיסון והעברה ל 1.5 mL צנטריפוגה צינורות המכילים 50 μL של מים באולטרמטוהרים. להשעות, ומערבולת בקצרה, ו דגירה עבור 7 דקות על בלוק חימום ב 100 ° c. צנטריפוגה ב 16 000 x g עבור 3 דקות ולהשתמש בפיפטה כדי להעביר בזהירות את supernatant לתוך שפופרת ריקה 1.5 mL. המשך לשלב הבא באמצעות הסופרנטאנט כ-DNA תבנית או חנות ב-20 ° c עד למועד זה. 2. התקנת מולטיפלקס ותנאי רכיבה על אופניים הערה: כל מדדי היקף התגובה (2 לכל Y. תרמילי בידוד) צריך להכיל 12.5 μl של 2X מולטיפלקס PCR פלוס מיקס הורים, 0.1 כדי 0.2 μm של כל מתאים פריימר המתאים (טבלה 1) ו 3 μl של ה-DNA תבנית, מותאם נפח התגובה הסופי של 25 μl על ידי תוספת של מים בחינם RNase. המטרה לשמור על חשיפת אור של המסומנת מתויג קדימה-התחל לפחות (למשל, על ידי גלישת צינורות האחסון שלהם ברדיד אלומיניום). עבור כל אחד משני המגה-בתים של ה-PCR (שולחן 1), הכן תערובות מאסטר כמתואר לעיל (ללא DNA תבנית) על פי מספר הדגימות ועוד אחת חיובית ושליטה אחת שלילית. בנוסף, אפשר לנפח של 10% עודף. מערבולת המאסטר המוכן מתערבב בעדינות במהירות נמוכה. הפץ 22 μL של כל מיקס בנפרד לתוך בארות בודדות על רצועות ה-PCR או צלחות, בהתאם למספר הדגימות, ולהוסיף 3 μL של תבנית לכל באר (עבור פקדים חיוביים ושליליים, בהתאמה, להשתמש ב-DNA מתוך מאומת Y. תרמילי מים מסננים ומטוהרים. . תאטום וצנטריפוגה בקצרה הפעל את כל הדגימות על הציקליום התרמי של ה-PCR עם התוכנית הבאה: (i) 5 דקות ב 95 ° צ’ (ii) 30 מחזורים של 0.5 דקות ב 95 ° צ’, 1.5 דקות ב-60 ° c, ו 1 דקות ב-72 ° c ו-(iii) 60 דקות ב-68 ° c, ואחריו קירור עד 4 ° התוכנית תושלם בתוך פחות מ 3 שעות. 3. מבוא לאישור מטעם PCR על פי ההמלצות של היצרן, להכין נפח של 1.5% (w/v) agarose ג’ל ב-1x טריס-borate-EDTA (להיות) מאגר מתאים מספר תגובות ה-PCR להיבדק. לפני הליהוק, להוסיף 5 μL של לצבוע את גרעין של חומצה פלואורסצנטית לכל 50 μL של הפתרון ג’ל ומערבבים. השימוש מגשים מסרקים לפי הצורך ליהוק, השארת מספר מתאים של בארות חינם עבור מדרגות התייחסות DNA. לאחר ההגדרה, הטבול את ג’ל ב-1x TBE-חוצץ במערכת GE. מערבבים 5 μL של המוצר PCR יחד עם 2 μL של טעינת צבע והעברה ג’ל בארות. הוסף 5 μL של סולם DNA בבארות ריקות לעיון. הפעל את הג ב-110 V לכל 15 ס מ בערך 1 h והשתמש במערכת דימות/ויזוליזציה מבוססת-UV כדי לאמת את הנוכחות של מספר (עד חמש) להקות המייצגות את ה-PCR הגברה (ראה דוגמה באיור 1). . התעלם מהג המשך לשלב הבא או אחסן את מוצרי ה-PCR הנותרים ב-4 ° c עד לעיבוד נוסף. 4. התקנת אלקטרופורזה קפילר ותנאי הפעלה לאחר אישור של PCR הגברה, דלל את מוצרי PCR 1:10 (v/v) במים מטוהרים. . לאטום, לערבב ולצנטריפוגה בקצרה עבודה בחדר מיקס, להכין נפח של ערבוב הורים המורכב 9 μL של הטופסו 0.5 μL של תקן גודל לכל מוצר PCR (לאפשר 10% עודף נפח). מערבולת בקצרה ולהפיץ 9.5 μL לבארות על צלחת המתאימה למערכת CE הזמינים, לפני הוספת 0.5 μL של מוצר PCR מדולל. . לאטום, לערבב ולצנטריפוגה בקצרהזהירות: . טפל בזהירות ערבוב של הפורמיד עם המים. יוצר חומצה פורמית, שהיא רעילה באמצעות הציקליום התרמי של ה-PCR, השתמש בדגימות של 95 ° c עבור 3 דקות לפני הצינון עד 4 ° c ללא הגבלת זמן. צנטריפוגה לזמן קצר ולטעון את הצלחת אל מערכת CE מכויל על פי הוראות היצרן. הפעל ניתוח מקטעים CE באמצעות ריאגנטים המתאים למנגנון הבחירה ולהגדרות הבאות: 60 ° c; 5 s זריקות ב 1.6 kV (32 V לכל ס מ); 32 דקות ריצה זמן ב 15 kV (300 V לכל ס מ). CE ניתוח קטע של 24 בארות על 24-נימי (50 ס מ) בדרך כלל לוקח כ 50 דקות. 5. שיחות גודל VNTR, חישוב ספירה חוזרת ויצירת פרופיל MLVA הערה: שלב 5.1 מתאר את מידת הקריאה של Y. תרמילי vntr מקבצי electropherogram באמצעות התוכנה הספציפית המופיעה ברשימת החומרים. עיין במדריך התוכנה לקבלת פרטים נוספים ופתרון בעיות. לשימוש בתוכנות אחרות, יש להתייעץ עם מדריכים מתאימים. יבא קבצי תוצאת CE (שניים בכל לבודד). הגדר את שיטת הניתוח לברירת מחדל של Microsatellite ובחר את הבחירה המתאימה במוצר תחת גודל סטנדרטי, לפני לחיצה על לחצן נתח. בדוק את הזיהוי הנכון של קטעים סטנדרטיים בגודל באמצעות עורך התאמת גודל ותקן הקצאות שגויות בעליל. לאחר שבחרת את המדגם (ים) להיקרא, ללחוץ על לחצן הצג מגרשים ולהקיש Ctrl + A כדי לאפשר תצוגה של טבלת שינוי גודל. בעוד בלוח העליון, החזק את מקש Ctrl לאחר לחיצה על חמש הפסגות המייצגים את הגברה VNTR (השתמש בכלי התקרבות לפי הצורך).הערה: עבור כל אחד ממוצרי ה-PCR, הelectropherogram יראה חמש פסגות מופץ בין שלושת הצבעים המועסקים (ראה 5 ‘ התוויות צבע של התחל קדימה בטבלה 1 ואת שתי הדוגמאות באיור 2). הקש Ctrl + G כדי לסנן את טבלת שינוי הגודל, המציגה רק את המאפיינים של חמש הפסגות המסומנות, והקלט את הקריאות לגודל CE עבור כל מקור vntr (עם התייחסות לטבלה 1) עבור יישום במורד הזרם. על מנת להסביר את דפוסי הניידות במהלך לסה נ, יש לחשב ספירה חוזרת מדויקת של VNTR בהתאם לנוסחה המסופקת להלן, תוך שימוש בשיחות בגודל VNTR ביחד עם משתנים ספציפיים לוקוס (ראה טבלה 1). ליעילות, מומלץ להפוך תהליך זה לאוטומטי (לדוגמה, באמצעות תבנית גיליון אלקטרוני). שחזור VNTR מחושב עגול מונה את המספר השלם הקרוב ביותר ומשרשר למחרוזות בעלות עשר ספרות, כל אחד מהם מייצג את פרופיל ה-MLVA של תרמילי בודד מספר 1. 6. אשכול עץ מורחב מינימלי ניתוח של נתוני MLVA הערה: שלב 6 מתאר את היצירה של דיאגרמות MST מנתוני Y. תרמילי mlva, באמצעות התוכנה הספציפית המופיעה ברשימת החומרים. עיין במדריך התוכנה לקבלת פרטים נוספים ופתרון בעיות. לשימוש בתוכנות אחרות, יש להתייעץ עם מדריכים מתאימים. צור מסד נתונים חדש ובוא לבחור להפעיל את תוסף MLVA. יבא מידע מסוג Y. תרמילי mlva ומטא-נתונים על-ידי בחירת נתונים של סוגי תווים ואחריהם ייבוא שדות ותווים (בחירה משנית נוספת בהתאם לתבנית האחסון). כשתתבקש, ציין כללי ייבוא בהתאם לתוכן קובץ הייבוא: בעמודה סוג יעד , סווג חזרה של vntr כערך תו: vntrוהמטא-נתונים השונים כפרטי הזנה: שדה מידע על ערכים .הערה: עבור השוואה והקשר, ניתן גם לייבא את קבוצת הנתונים כולה שפורסמה (גישה פתוחה) יחד עם הנייר המקורי המעסיק את הפרוטוקול MLVA14. הפרופילים של MLVA והמטא-נתונים על האוסף המגוון של מבודד Y. תרמילי (n = 484) בתוך מחקר זה זמין מהחומר המשלים שלה (טבלאות S1 ו-S2) באמצעות הקישור הבא: https://aem.asm.org/content/84/16/e00730-18/figures-only#fig-data-additional-files בחלונית ‘ סוג ניסוי ‘, פתחו את ערך vntr וקבעו ערכי מינימום ומקסימום לכל מקום vntr ל- 0 ו- 100, בהתאמה. תחת הגדרות כלליות, הגדר את מספר הספרות העשרוניות ל -0 ובחר מספרים תחת סוג נתונים. בדוק אם יש ערכים חסרים כאפס. בחרו דוגמאות מיובאות שנועדו לניתוח אשכול MST ולחצו על הלחצן ‘ צור השוואה חדשה ‘ (בחלונית ‘ השוואה ‘). אם תרצה להציג את התצוגה החזותית של ה-MST, הקצה את הדגימות לקבוצות צבעוניות (לדוגמה, לפי תכונת מטה-נתונים מסוימת) על-ידי שימוש באפשרויות השונות הזמינות בחלונית ‘ קבוצות ‘.הערה: ניתן גם ליצור/לשנות קבוצות באופן שונה, בהמשך לשלבים הבאים. בחר ניתוח אשכולות מתקדם. .. ו- MST עבור נתוני הקטקטל כדי ליצור דיאגרמת MST המבוססת על הדוגמאות שנבחרו. שינוי נוסף של המצגת החזותית של MST כמועדפת (למשל, על ידי הוספת פרמטרים לחלוקה למחיצות, צומת/ענף תוויות, מרובי קישורים, אגדות, וכו ‘). ראה דוגמה באיור 3.הערה: אשכול (מתחם שבטים) לחלוקה לסף של ≤ 4/10 לא זהה VNTR הבית, בנוסף להסתרת חיבורי הסניפים המייצגים > 5/10 לא זהה VNTR הבית, בעבר הועסק ניתוח אשכול MST מבוסס על מידע MLVA שנוצר באמצעות פרוטוקול זה14. בתנאי שערכת הנתונים הנ ל של 484 Y. תרמילי מילאן הייתה מיובאת, ניתן לכלול דוגמאות אלה גם עבור ניתוח אשכול MST (כפי שמתואר לעיל) כדי לספק הקשר גלובלי והיסטורי. זה יהיה למשל להקל על זיהוי של כל הדגימות המזוהה עם מתחמי שבטים שתוארו בעבר, כמו גם אלה המייצגים ליננים שאינם מתוארים עדיין. בהתאם למטא-נתונים הזמינים, ניתן לחשוף את דיאגרמת MST שתיווצר בדרכים שונות, לדוגמה, כדי לגלות את דפוסי הקיבוץ בסופו של דבר המקושרים לתכונות מסוימות (גיאוגרפיה, מחשב מארח, זמן וכו ‘). במקרה הצורך, יצא את ה-MST הסופי בתבנית הרצויה באמצעות בחירת תמונת הייצוא .