Multi-locus Nombre variable Tandem-répétition Analyse du Bacterium Yersinia ruckeri par Multiplex PCR et Capillary Electrophoresis

CAUTION: Pour l’ensemble du protocole, il est conseillé d’effectuer toutes les procédures de laboratoire humide stérilement en l’utilisation de blouses de laboratoire, gants jetables et réactifs stériles et de l’équipement. Il est également conseillé de préparer les réactions PCR dans une pièce séparée (pré-PCR) non utilisée pour l’amplification et/ou la manipulation des PCR (post-PCR). Entreposez tous les réactifs comme le recommande le fabricant. Voir Tableau des matériaux pour plus de détails sur les réactifs, l’équipement et les logiciels utilisés. 1. Cultivation bactérienne et extraction de l’ADN génomique Semez les cultures pures Y. ruckeri sur n’importe quel type d’agar approprié (les auteurs ont utilisé 5% d’agar de sang bovin) et couve à 22 oC pendant 1-2 jours, ou 15 oC pendant 3-4 jours. Dans chaque plaque d’agar, choisissez une seule colonie représentative avec une boucle d’inoculation et transférez-les dans des tubes centrifugeuses de 1,5 ml contenant 50 l d’eau ultrapurifiée. Suspendre, vortex brièvement, et incuber pendant 7 min sur un bloc de chauffage à 100 oC. Centrifugeuse à 16 000 x g pendant 3 min et utiliser une pipette pour transférer soigneusement le supernatant dans un tube vide de centrifugeuse de 1,5 ml. Passez à l’étape suivante en utilisant le supernatant comme modèle d’ADN ou entreposez-le à -20 oC jusqu’à ce que ce soit. 2. Configuration multiplex PCR et Conditions de cyclisme REMARQUE: Chaque réaction multiplex PCR (deux par isolat Y. ruckeri) doit contenir 12,5 L de mix principal 2x Multiplex PCR Plus, 0,1 à 0,2 M de chaque paire d’amorce appropriée (tableau 1) et 3 l d’ADN de modèle, ajusté à un volume de réaction final de 25 l par ajout d’eau sans RNase. Viser à maintenir l’exposition légère des amorces avant étiquetées fluorescentes à un minimum (p. ex., en enveloppant leurs tubes de rangement dans du papier d’aluminium). Pour chacun des deux essais de PCR multiplex (tableau 1), préparez les mélanges principaux tels que décrits ci-dessus (sans ADN de modèle) en fonction du nombre d’échantillons plus un contrôle positif et négatif. De plus, prévoyez un volume excédentaire de 10 %. Vortex le maître préparé se mélange doucement à basse vitesse. Distribuer 22 L de chaque mélange maître séparément dans des puits individuels sur des bandes ou des plaques PCR, le cas échéant pour le nombre d’échantillons, et ajouter 3 l de modèle à chaque puits (pour des contrôles positifs et négatifs, respectivement, utiliser l’ADN d’un Y. ruckeri vérifié l’eau ultrapurifiée). Sceau et centrifugeuse brièvement. Exécuter tous les échantillons sur un cycleur thermique PCR avec le programme suivant : (i) 5 min à 95 oC (ii) 30 cycles de 0,5 min à 95 oC, 1,5 min à 60 oC et 1 min à 72 oC, et (iii) 60 min à 68 oC, suivi d’un refroidissement à 4 oC indéfiniment. Le programme se terminera en moins de 3 h. 3. CONFIRMATION pcR Amplicon par Gel Electrophoresis Selon les recommandations du fabricant, préparer un volume de 1,5 % (w/v) gel d’agarose dans un tampon 1x tris-borate-EDTA (TBE) approprié pour le nombre de réactions PCR à tester. Avant la coulée, ajouter 5 ll de colorant en acide nucléique fluorescent par 50 l de solution de gel et mélanger. Utilisez des plateaux et des peignes comme approprié pour la coulée, en laissant un nombre approprié de puits libres pour les échelles de référence en ADN. Après le réglage, immerger le gel dans 1x TBE-buffer dans un système GE. Mélanger 5 L de produit PCR avec 2 l l de colorant de chargement et transférer dans des puits de gel. Ajouter 5 ll d’échelle d’ADN dans des puits vides pour référence. Faites fonctionner le gel à 110 V par 15 cm pendant environ 1 h et utilisez un système d’imagerie/visualisation de gel à base d’UV pour vérifier la présence de plusieurs bandes (jusqu’à cinq) représentant des amplicônes PCR (voir exemple à la figure 1). Jetez le gel. Passez à l’étape suivante ou entreposez les produits PCR restants à 4 oC jusqu’à ce que le traitement se poursuive. 4. Conditions d’aménagement et de course d’électrophorèse capillaires Après confirmation des amplicons PCR, diluer les produits PCR 1:10 (v/v) dans de l’eau purifiée. Sceller, mélanger et centrifuger brièvement. En travaillant dans un placard à fumées, préparer un volume de mélange maître composé de 9 l de formamide et de 0,5 L de taille standard par produit PCR (permettre un volume excédentaire de 10 %). Vortex brièvement et distribuer 9,5 L dans des puits sur une plaque appropriée pour le système CE disponible, avant d’ajouter 0,5 L de produit PCR dilué. Sceller, mélanger et centrifuger brièvement.MISE EN GARDE: Manipulez avec soin. Le mélange du formamide avec de l’eau génère de l’acide formique, qui est toxique. À l’aide d’un cycleur thermique PCR, dénaturer les échantillons à 95 oC pendant 3 min avant de les refroidir à 4 oC indéfiniment. Centrifugeuse brièvement et chargez la plaque sur un système CE calibré selon les instructions du fabricant. Exécuter l’analyse des fragments CE à l’aide de réactifs appropriés pour l’appareil de choix et les réglages suivants : 60 oC; 5 injections à 1,6 kV (32 V par cm); Temps de course de 32 min à 15 kV (300 V par cm). L’analyse du fragment de CE de 24 puits sur un 24-capillaire (50 cm) prendra généralement environ 50 min. 5. Appel de taille VNTR, calcul du nombre de répétitions et profilage MLVA REMARQUE: L’étape 5.1 décrit y. ruckeri VNTR CE taille appelant à partir de fichiers électrophériques, en utilisant le logiciel spécifique énuméré sa liste dans tableau des matériaux. Consultez le manuel logiciel pour plus de détails et de dépannage. Pour l’utilisation d’autres logiciels, consultez les manuels appropriés. Importer les fichiers de résultats CE (deux par isolat Y. ruckeri). Définir la méthode d’analyse par défaut microsatellite et sélectionnez le choix de produit approprié sous la norme de taille, avant d’appuyer sur le bouton Analyse. Vérifier l’identification correcte des fragments standard de taille à travers l’éditeur de taille match et corriger toute allocation visiblement erronée. Après avoir sélectionné l’échantillon (s) à lire, appuyez sur le bouton Affichage Plots et appuyez sur Ctrl-A pour activer la vue de la table de dimensionnement. Dans le panneau supérieur, maintenez Ctrl en cliquant sur les cinq pics représentant les amplicons VNTR (utiliser l’outil de zoom au besoin).REMARQUE: Pour chacun des produits multiplex PCR, l’électrophétogramme montrera cinq pics répartis entre les trois colorants utilisés (voir 5′ étiquetage teinture des amorces avant dans le tableau 1 et les deux exemples de la figure 2). Appuyez sur Ctrl-G pour filtrer la table de dimensionnement, ne montrant que les caractéristiques des cinq pics mis en évidence, et enregistrez les appels de taille CE pour chaque locus VNTR (en référence au tableau 1) pour l’application en aval. Afin de tenir compte des modèles biaisés de mobilité des amplicons pendant le CE, calculez des comptes de répétition VNTR précis selon la formule fournie ci-dessous, en utilisant des appels de taille VNTR CE ainsi que des variables spécifiques au locus (voir le tableau 1). Pour plus d’efficacité, il est conseillé d’automatiser ce processus (par exemple, à l’aide d’un modèle de feuille de calcul). La répétition VNTR calculée en rond compte à l’entiereteur le plus proche et se concatenate en cordes à dix chiffres, chacune représentant le profil MLVA d’un seul isolat Y. ruckeri. 6. Analyse minimale des grappes d’arbres de MLVA REMARQUE: L’étape 6 décrit la création de diagrammes MST à partir des données Y. ruckeri MLVA, à l’aide du logiciel spécifique énuméré dans tableau des matériaux. Consultez le manuel logiciel pour plus de détails et de dépannage. Pour l’utilisation d’autres logiciels, consultez les manuels appropriés. Créez une nouvelle base de données et optez pour activer le plugin MLVA. Importer les profils et métadonnées Y. ruckeri MLVA en sélectionnant les données de type Caractère suivies des champs et des caractères d’importation (plus de sous-sélection selon le format de stockage). Lorsque vous êtes invité, spécifiez les règles d’importation en fonction du contenu du fichier d’importation : Dans la colonne de type Destination, classez les comptes de répétition VNTR comme valeur de caractère : VNTR, et les métadonnées diverses comme informations d’entrée : Champ d’informations d’entrée .REMARQUE: Pour la comparaison et le contexte, il est également possible d’importer l’ensemble des données publiées (accès libre) ainsi que le papier original utilisant le protocole MLVA actuel14. Les profils MLVA et les métadonnées sur la collection variée d’isolats Y. ruckeri (n ‘ 484) examinés dans cette étude sont disponibles à partir de son matériel supplémentaire (tableaux S1 et S2) par le biais du lien suivant : https://aem.asm.org/content/84/16/e00730-18/figures-only#fig-data-additional-files Dans le panneau de type Expérience, ouvrez l’entrée VNTR et fixez des valeurs minimales et maximales pour chaque locus VNTR à 0 et 100, respectivement. Dans les paramètres généraux, définir le nombre de chiffres décimal s’agitder de 0 et sélectionner des nombres sous type De données. Vérifiez que les valeurs absentes sont nulles. Sélectionnez les échantillons importés destinés à l’analyse des grappes MST et cliquez sur le bouton Créer un nouveau bouton de comparaison (en panneau de comparaison). Si vous le souhaitez pour la présentation visuelle du TMS, répartir les échantillons à des groupes de couleur (p. ex., selon un trait de métadonnées particulier) en utilisant les différentes options disponibles dans le panel Groupes.REMARQUE: Les groupes peuvent également être créés/modifiés rétrospectivement, après les étapes suivantes. Sélectionnez l’analyse avancée des grappes… et mST pour les données catégoriques afin de générer un diagramme MST basé sur les échantillons choisis. Modifier davantage la présentation visuelle du MST selon la préférence (p. ex., en ajoutant des paramètres de partitionnement, un étiquetage noeud/branche, des liens croisés, des légendes, etc.). Voir l’exemple dans la figure 3.REMARQUE: Un seuil de partitionnement de cluster (complexe clonal) de 4/10 loci VNTR non identiques, en plus de cacher les connexions de branche représentant les loci VNTR non identiques, a déjà été utilisé pour l’analyse des grappes MST basée sur les données MLVA générées en utilisant ce protocole14. À condition que l’ensemble de données susmentionné de 484 profils Y. ruckeri MLVA soit importé, ces échantillons peuvent également être inclus pour l’analyse des grappes MST (comme décrit ci-dessus) afin de fournir un contexte global et historique. Cela facilitera, par exemple, l’identification de tous les échantillons affiliés à des complexes clonaux décrits antérieurement, ainsi que ceux représentant des lignées encore non décrites. Selon les métadonnées disponibles, le diagramme MST qui en résulte peut être examiné de différentes manières, par exemple pour découvrir d’éventuels modèles de regroupement liés à des traits particuliers (géographie, hôte, temps, etc.). Si nécessaire, exportez le MST finalisé dans un format souhaité à l’aide de la sélection d’images Export.